【摘要】：生物丁醇因其優(yōu)良特性成為備受關(guān)注的新型可再生燃料,同時(shí),丁醇還是一種重要平臺(tái)化合物、萃取劑和車輛剎車制動(dòng)劑等。目前,生物丁醇主要來源于梭菌屬(clostridia)細(xì)菌丙酮丁醇乙醇厭氧發(fā)酵(ABE發(fā)酵)。但是,相對(duì)于石油化工化學(xué)法來源的丁醇,生物丁醇發(fā)酵生產(chǎn)存在產(chǎn)量和效率偏低等問題,導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。因此,提高生物丁醇市場競爭力的核心是解決ABE發(fā)酵生產(chǎn)成本問題,通過調(diào)研分析,可從以下方面突破:1)增加菌株對(duì)氧的耐受性;2)提高溶劑產(chǎn)量和生產(chǎn)效率;3)降低溶劑對(duì)細(xì)胞的毒害;4)尋找廉價(jià)非糧發(fā)酵原料;5)提高菌株穩(wěn)定性,使其優(yōu)良特性不易退化。為此,本文選取拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)為對(duì)象,從增加菌株對(duì)氧的耐受性、提高溶劑產(chǎn)量和生產(chǎn)效率,以及廉價(jià)非糧原料發(fā)酵等方面深入研究,以期降低生產(chǎn)成本,并分析其高產(chǎn)機(jī)理。取得如下主要研究成果:(1)成功構(gòu)建一株拜氏梭菌耐氧突變株(Cbei_1336 mutant),并發(fā)現(xiàn)其丁醇和丙酮的產(chǎn)量和產(chǎn)率顯著提高。利用二型內(nèi)含子插入法成功敲除拜氏梭菌產(chǎn)溶劑退化菌株(C.beijerinckii DS)中參與過氧化物還原機(jī)制調(diào)節(jié)的Per R抑制子基因Cbei_1336,獲得一株耐氧的兼性厭氧突變株。該突變株不但可以在有氧環(huán)境中生長良好,且與出發(fā)菌株相比,發(fā)酵液中生物量提高8.11±0.11(OD600)(3.67±0.35倍),丙酮和丁醇濃度分別提高4.7±0.40 g/L(32.78±0.02倍)和10.01±0.57 g/L(57.23±0.01倍),總?cè)軇┥a(chǎn)效率由產(chǎn)溶劑退化株的0.07±0.01 g/L/h提高到突變株的0.19±0.01 g/L/h,產(chǎn)率提高了2.71±0.01倍。(2)基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步分析了耐氧突變株(Cbei_1336 mutant)耐氧以及丁醇和丙酮產(chǎn)量和產(chǎn)率顯著提高的分子機(jī)理。通過比較分析C.beijerinckii DS和Cbei_1336 mutant在發(fā)酵12h、24h和36h后細(xì)胞中的基因表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)的基因分別有2893、2597和3036條,除去其中未知蛋白后,在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共同上調(diào)的有975條,共同下調(diào)的有222條。Gene Ontology(GO)分析顯示,在共同上調(diào)和下調(diào)的基因中,參與代謝進(jìn)程(Metabolic process)的基因比例均是最多的,分別占26.69%和29.28%。進(jìn)一步的基因差異表達(dá)分析顯示,編碼ABE發(fā)酵代謝路徑關(guān)鍵酶:mannitol transporter subunit IIB,6-phosphofructokinase,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,pyruvate kinase,2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase subunit beta,acetyl-CoA acetyltransferase,acetoacetate decarboxylas和NADPH-BDH等基因在Cbei_1336 mutant中顯著上調(diào),而編碼phosphate acetyltransferase(PTA)和acetate kinase的基因在Cbei_1336 mutant中顯著下調(diào)。此外,編碼參與氧化還原進(jìn)程的Ferredoxin,flavodoxin,rubrerythrin和radical SAM protein;編碼參與細(xì)胞解毒的glutaredoxin,multicopper oxidase(MCO)和Superoxide dismutase(SOD);編碼參與金屬離子相關(guān)的能量代謝的iron-dicitrate ABC transporter ATP-binding protein,iron transporter(FeoB)和manganese transporter;編碼參與孢子形成的small acid-soluble spore protein(SASP)和spore coat protein等基因在Cbei_1336 mutant發(fā)酵的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào),推測葡萄糖消耗和產(chǎn)溶劑進(jìn)程、細(xì)胞解毒與氧化還原進(jìn)程、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)和產(chǎn)孢進(jìn)程可能在Cbei_1336 mutant的耐氧機(jī)制和高的溶劑產(chǎn)量和產(chǎn)率中發(fā)揮了重要作用。(3)研究發(fā)現(xiàn)作為黃姜淀粉糖化液(saccharification liquid of DZW starch,SLDS)是一種廉價(jià)非糧原料,可顯著提高C.beijerinckii ABE發(fā)酵丁醇和丙酮的產(chǎn)量和產(chǎn)率。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)P_2培養(yǎng)基相比,SLDS可有效提高C.beijerinckii ABE發(fā)酵的生物量,葡萄糖消耗量和消耗速率,以及溶劑丙酮和丁醇的生產(chǎn)量和生產(chǎn)速率,有效縮短發(fā)酵周期24h左右。通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析黃姜淀粉粗糖液和P2培養(yǎng)基發(fā)酵液中12h菌株基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)SLDS為底物的培養(yǎng)基中丙酮和丁醇產(chǎn)量和產(chǎn)率的提高與葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Cbei_0242),丙酮酸激酶(Cbei_0485),乙酰乙酸脫羧酶(Cbei_3835),依賴NADPH的丁醇脫氫酶(Cbei_2181)和依賴NADH的丁醇脫氫酶(Cbei_2421)5個(gè)葡萄糖消耗和丙酮丁醇生產(chǎn)的核心代謝酶基因的上調(diào)表達(dá)相聯(lián)系。SLDS是黃姜皂素產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物,它的排放不僅會(huì)導(dǎo)致大量營養(yǎng)物質(zhì)流失,而且還會(huì)給環(huán)境造成污染。因此,對(duì)SLDS的利用可降低ABE發(fā)酵生產(chǎn)生物丁醇的成本,還可以大幅減少環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。
【圖文】：

黃姜淀粉糖液的具備以上優(yōu)良特性，本文也對(duì)黃姜淀粉糖液的研究與利用現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并探討了將其用于 ABE 發(fā)酵的可行性及前景。1.1 世界能源現(xiàn)狀和未來發(fā)展趨勢隨著人類文明的進(jìn)步和人類社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們對(duì)能源的需求和消耗越來越大。在國際能源署（International EnergyAgency，IEA）2014 年發(fā)布的報(bào)告《KeyWorld Energy Statistics 2014》中，對(duì) 1971-2012 年世界能源消費(fèi)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了總結(jié)（圖 1-1），顯示了人類對(duì)能源的需求日益攀升。圖 2-1 顯示，截止 2012 年世界能源需求量已經(jīng)達(dá)到 13371 百萬噸油當(dāng)量（milloin tons of oil equivalent，，Mtoe），化石燃料仍然是全球能源消費(fèi)的主體占（81.7%），其中，原油（Oil）占 31.4%，煤炭（Coal）占 29%，天然氣（Natural gas）占 21.3%；另外，新型能源中，核能（Nuclear）占 4.8%，水電（Hydro）占 2.4%，生物燃料（Biofuels and waste）占 10.0%[1,2]。

圖 1-2 2012 年各種燃料在基礎(chǔ)能源總量中的占有率（引自[1]）ure 1-2 Occupancy of various fuels in total primary energy supply in 2油公司（BPp.l.c，BP）在其 2015 年 2 月發(fā)布的《BP2035 世和人均收入增加是能源需求增長的關(guān)鍵因素，預(yù)計(jì)到 203，預(yù)示著增加了 16 億需要能源的人口。其中，中國和印鍵驅(qū)動(dòng)因素，到 2035 年，兩國共占的人口和國內(nèi)生產(chǎn)總值分別成為世界第一和第三大經(jīng)濟(jì)體。圖 1-3 給出了 1965-2勢來看，盡管到 2035 年化石燃料仍是主導(dǎo)性能源，但它 年的 86%降至 81%；在非化石燃料中，包括生物燃料在內(nèi)高，從 2015 年的 3%升至 2035 年的 8%，并在 2020 年超過3]。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ923

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本文編號(hào)：2626994