黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國(guó)重要的園藝作物之一。黃瓜也是一種典型的喜氮作物,氮素缺乏會(huì)嚴(yán)重影響植株的生長(zhǎng),最終影響黃瓜的產(chǎn)量及品質(zhì)。為了追求更高的產(chǎn)量,黃瓜生產(chǎn)上會(huì)出現(xiàn)過(guò)量施用氮肥的現(xiàn)象,過(guò)量施用氮肥時(shí)作物對(duì)氮的利用率低,并且殘留的氮肥會(huì)破壞農(nóng)業(yè)及生態(tài)環(huán)境,科學(xué)施用氮肥的同時(shí)挖掘黃瓜響應(yīng)低氮基因、培育響應(yīng)低氮黃瓜品種是解決上述問(wèn)題的有效途徑。本研究以黃瓜D0328為試驗(yàn)材料,結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果,利用RT-PCR同源序列克隆技術(shù),克隆黃瓜響應(yīng)氮素脅迫相關(guān)基因CsAOC3,利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)CsAOC3表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè),并進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:（1）結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)果,篩選獲得了一個(gè)可能參與黃瓜響應(yīng)氮素脅迫的基因CsAOC3,以黃瓜葉片cDNA為模板,利用黃瓜基因組網(wǎng)站基因序列信息設(shè)計(jì)引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增出1條約750 bp的亮帶,測(cè)序結(jié)果表明其基因全長(zhǎng)為753 bp,蛋白編碼251個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)的分子量為27.17kD,不穩(wěn)定系數(shù)為51.92,理論等電點(diǎn)為8.93,平均親水系數(shù)為-0.155。蛋白同源比對(duì)結(jié)果表明C... 

【文章來(lái)源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－３?蛋Ｈ保守結(jié)構(gòu)域分析??

?１??０２??圖３－４?ＣｓＡＯＣ３蛋Ｈ與其他植物ＡＯＣ蛋閂系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析??Ｆｉｇ．３－４?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＣｓＡＯＣ３?ｐｒｏｔｅｉｎ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?ｐｌａｎｔ?ＡＯＣ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??３．４?Ｃ＾４０Ｃ３在低氮脅迫條件下的表達(dá)分析??在播種３７?ｄ后對(duì)低氮處理和正常氮處理的兩個(gè)黃瓜品系Ｄ０３２８和Ｄ０４２２第３片葉進(jìn)行??取材，提取總ＲＮＡ，通過(guò)反轉(zhuǎn)朵獲得ｃＤＮＡ〇利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)對(duì)Ｄ０３２８和Ｄ０４２２兩個(gè)響??應(yīng)低氮能力不同的黃瓜品系在低氮和正常氮情況下表達(dá)情況進(jìn)行了分析（圖５）。??結(jié)果表明，和正常氮處理相比，響應(yīng)低氮脅迫的黃瓜Ｄ０３２８在低氮脅迫條件件下ＣＭＯＣＪ的??表達(dá)景顯著上調(diào)，增加了?１１倍之多；而對(duì)于響應(yīng)低氮脅迫弱的黃瓜Ｄ０４２２，在低氮脅迫處理??和正常氮處理時(shí)Ｃ＾ＩＯＣＪ的表達(dá)量并沒(méi)有明顯變化（圖５）。??１６

３．５．３質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證??對(duì)經(jīng)過(guò)純化回收的目的片段再用限制性內(nèi)切酶；Ｉ和Ｉ對(duì)其進(jìn)行雙酶切鑒定。??ＰＣＲ結(jié)果顯示如圖３－８，泳道２、３為ＰＣＲ擴(kuò)增出的耐低氮基因Ｃ＾ＯＣ？片段，進(jìn)一步證明??Ｃ＾４（？Ｃ５基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入表達(dá)載體。??．￥■?＇＾―ｉ??Ｍ：２ＫＭａｋｅｎ?２、３目的基因條帶：丨、４：陰性對(duì)照??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?２Ｋ；?２，?３：?ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ?ｂａｎｄ；?１，４：?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｐｌａｎｔ；??圖３－８重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證??Ｆｉｇ?３－８?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｗａｓ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??３．５．４重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌??農(nóng)桿菌是常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系，又被稱為“自然界最小的遺傳工程師”，農(nóng)桿菌介??疔法具有簡(jiǎn)便、高效、低拷Ｗ數(shù)等特點(diǎn)【７３］。本研究也試圖通過(guò)農(nóng)桿菌將ＲＮＡ干涉片段疔入??擬南芥中。因此，將ＰＢＩ１２１－Ｃ＾ＯＣＪ表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)奸菌是構(gòu)建ＲＮＡ表達(dá)載體的關(guān)鍵一步。??本實(shí)驗(yàn)采用冷溶法制備感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)已導(dǎo)入超表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌提取質(zhì)粒ＤＮＡ，進(jìn)行??ＰＣＲ檢測(cè)，檢測(cè)其是否含有表達(dá)載體，結(jié)果如３－９圖，泳道１、２、３、４、５含有Ｈ的條帶，??表明該菌落含有已經(jīng)構(gòu)建好的載體，并從中選出最好的陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以便于對(duì)擬??南芥進(jìn)行侵染。??２０??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]An ACCUMULATION AND REPLICATION OF CHLOROPLASTS 5 gene mutation confers light green peel in cucumber[J]. Qian Zhou,Shenhao Wang,Bowen Hu,Huiming Chen,Zhonghua Zhang,Sanwen Huang.  Journal of Integrative Plant Biology. 2015(11)
[2]低氮脅迫對(duì)不同耐低氮性玉米品種苗期生長(zhǎng)和生理特性的影響[J]. 李強(qiáng),羅延宏,龍文靖,孔凡磊,楊世民,袁繼超.  草業(yè)學(xué)報(bào). 2014(04)
[3]黃瓜嫩果皮顏色的遺傳研究[J]. 王建科,方小雪,李雪紅,陳瑤,萬(wàn)正杰,徐躍進(jìn).  園藝學(xué)報(bào). 2013(03)
[4]黃瓜白色果皮基因遺傳規(guī)律及定位研究[J]. 董邵云,苗晗,張圣平,劉苗苗,王燁,顧興芳.  西北植物學(xué)報(bào). 2012(11)
[5]唐菖蒲丙二烯氧化物環(huán)化酶基因GhAOC的克隆與表達(dá)分析[J]. 連青龍,李曉昕,鐘雄輝,尹義蕾,義鳴放.  中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2012(05)
[6]黃瓜果實(shí)相關(guān)性狀QTL定位分析[J]. 苗晗,顧興芳,張圣平,張忠華,黃三文,王燁,程周超,張若緯,穆生奇,李曼,張振賢,方智遠(yuǎn).  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(24)
[7]黃瓜無(wú)毛基因gl-2的遺傳分析和定位[J]. 楊雙娟,苗晗,張圣平,程周超,周健,董邵云,Todd C.Wehner,顧興芳.  園藝學(xué)報(bào). 2011(09)
[8]黃瓜嫩果白色果皮顏色遺傳規(guī)律及其AFLP標(biāo)記研究[J]. 孫曉丹,商慶梅,秦智偉.  北方園藝. 2011(03)
[9]Chi基因的克隆及轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的獲得[J]. 張茹,李金花,柴兆祥,張俊蓮,張金文,王蒂.  草業(yè)學(xué)報(bào). 2009(06)
[10]茉莉酸類化合物的合成研究進(jìn)展[J]. 李祖光,李建亮,沈德隆.  浙江化工. 2008(09)

博士論文
[1]水稻耐低氮基因克隆與功能分析[D]. 張陽(yáng)軍.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]大豆氮素利用效率相關(guān)基因的克隆及功能驗(yàn)證[D]. 郝青南.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2013
[3]耐鹽相關(guān)基因mangrin和ZRP4的克隆、分析與功能研究[D]. 張文惠.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2006

碩士論文
[1]長(zhǎng)春花茉莉酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)分析[D]. 王名雪.上海交通大學(xué) 2013
[2]黃瓜固定標(biāo)記圖譜的構(gòu)建及果皮光澤（D）、小刺（ss）性狀定位及甘藍(lán)抽薹性狀基因的分子標(biāo)記定位[D]. 杜輝.上海交通大學(xué) 2008
[3]紅樹(shù)林耐鹽基因（AOC）的克隆及其轉(zhuǎn)化熱研五號(hào)柱花草的初步探討[D]. 段瑞軍.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3292413