發(fā)掘并克隆大蔥細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility, CMS）目關(guān)基因,是闡明其CMS分子機理的關(guān)鍵。本研究以鞭桿蔥不育系和保持系為材料,采用同源克隆與環(huán)化RNA反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（CR-RT-PCR）技術(shù)方法相結(jié)合克隆大蔥線粒體基因atp6, atpA, nad9, nad5, orfl 92, orflll, orfl 00, mat-R全長；通過序列對比,找出鞭桿蔥雄性線粒體基因不育系與保持系之間的差異；同時對這些候選基因進行差異表達分析。對以上結(jié)果進行綜合分析,最終確認雄性不育候選基因,以便進行深入研究。主要結(jié)果如下：1、CR-RT-PCR技術(shù)的優(yōu)化以鞭桿蔥花蕾為材料,通過改變RNA反應(yīng)時間和試劑添加對環(huán)化RNA反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（CR-RT-PCR）技術(shù)進行了優(yōu)化,并用優(yōu)化后的技術(shù)克隆大蔥線粒體cob基因的全長。結(jié)果表明最優(yōu)環(huán)化反應(yīng)條件為：RNA首先65℃反應(yīng)5min，加入反應(yīng)試劑后15℃反應(yīng)2 h,最后70℃反應(yīng)10min使酶失活,反應(yīng)體系中不必添加催化劑PEG6000。實驗結(jié)果表明,cob基因全長為1522bp,無poly （A）尾,包... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 雄性不育的概述
        1.1.1 植物雄性不育的概念
        1.1.2 植物雄性不育的分類
    1.2 大蔥雄性不育的來源
        1.2.1 通過自然變異獲取大蔥雄性不育系
        1.2.2 通過種間雜交獲得大蔥雄性不育系
        1.2.3 通過基因工程獲得大蔥雄性不育系
    1.3 大蔥雄性不育機理的研究
        1.3.1 大蔥細胞質(zhì)雄性不育在形態(tài)水平的表現(xiàn)
        1.3.2 大蔥細胞質(zhì)雄性不育細胞形態(tài)學(xué)研究
        1.3.3 大蔥雄性不育的分子機理研究
    1.4 植物細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的研究開發(fā)
    1.5 植物雄性不育在生產(chǎn)中的應(yīng)用
    1.6 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植株材料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
    2.2 內(nèi)容與方法
        2.2.1 大蔥總RNA的提取
        2.2.2 RNA環(huán)化
        2.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增
        2.2.4 目的片段的回收
        2.2.5 目的片段的克隆
        2.2.6 目的基因全長的拼接及全長的克隆
        2.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹分析
        2.2.8 制備熒光熒光定量雙標(biāo)曲線cDNA模板
3 結(jié)果與分析
    3.1 CR-RT-PCR技術(shù)結(jié)果與分析
        3.1.1 RNA檢測
        3.1.2 CR-RT-PCR反應(yīng)中RNA環(huán)化反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.1.3 cob內(nèi)部基因的擴增
        3.1.4 cob序列測定與氨基酸結(jié)構(gòu)分析
        3.1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析
    3.2 雄性不育候選基因克隆結(jié)果與分析
        3.2.1 atp6基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析
        3.2.2 atpA基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析
        3.2.3 nad9基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析
        3.2.4 nad5基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析
        3.2.5 orf192基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析
        3.2.6 orf111基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析
        3.2.7 orf100基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析
        3.2.8 mat-R基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析
    3.3 雄性不育候選基因的qRT-PCR表達分析
4 討論
    4.1 CR-RT-PCR技術(shù)的探究
    4.2 線粒體能量代謝基因atp6與大蔥CMS的關(guān)系
    4.3 線粒體能量代謝基因atpA與大蔥CMS的關(guān)系
    4.4 NADH脫氫酶復(fù)合體基因與大蔥CMS關(guān)系
    4.5 orfs基因與大蔥CMS關(guān)系
    4.6 mat-R基因與CMS關(guān)系
5 全文總結(jié)
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3266867