黃瓜（Cucumis sativus）原產(chǎn)于亞熱帶,是一種冷敏感性蔬菜,在不適宜的低溫下貯藏極易發(fā)生冷害,從而影響黃瓜的貨架期及品質(zhì)。前人研究表明,外源MeJA和NO處理可減輕采后果蔬冷害的發(fā)生,但是這兩種物質(zhì)在誘導(dǎo)抗冷性中的作用及其相互關(guān)系尚不清楚。本論文研究了MeJA和NO對(duì)冷藏黃瓜抗氧化防御系統(tǒng)的影響及其與抗冷性的關(guān)系,并用異源表達(dá)方法對(duì)CsCAT3進(jìn)行了功能分析,主要研究結(jié)果如下:1.將黃瓜貯藏于不同的溫度,結(jié)果表明10℃是黃瓜的最適貯藏溫度;5℃會(huì)使黃瓜發(fā)生冷害,且在5℃下貯藏時(shí)間越長(zhǎng),轉(zhuǎn)到常溫20℃后貨架期最短。用0.1-10μmol·L^-1的SNP和MeJA處理黃瓜,然后置于5℃貯藏。結(jié)果表明,1μmol·L^-1的SNP、10μmol·L^-1的MeJA處理誘導(dǎo)黃瓜抗冷性的效果較好。2.MeJA和SNP處理降低了丙二醛含量,減緩了O₂^·-產(chǎn)生速率,降低了H₂O₂含量,上調(diào)了CsCAT1和CsCAT3基因和CAT3蛋白表達(dá),... 

【文章來(lái)源】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞表
第1章 前言
    1.1 研究背景
    1.2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.2.1 植物冷害的生理機(jī)制
            1.2.1.1 冷害對(duì)膜系統(tǒng)的影響
            1.2.1.2 冷害對(duì)抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響
        1.2.2 植物冷害的分子機(jī)制
        1.2.3 低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及不同信號(hào)途徑的“Cross-talk”
        1.2.4 與不同信號(hào)途徑的“交談”（Cross-talk）
            1.2.4.1 抗冷性與抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)系
        1.2.5 NO和MeJA在園藝作物誘導(dǎo)抗冷性中的研究進(jìn)展
        1.2.6 NO與MeJA之間的相互關(guān)系
    1.3 研究目的意義
第2章 MeJA和NO誘導(dǎo)黃瓜抗冷性的生理機(jī)理
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 試驗(yàn)材料與處理
            2.2.1.1 供試材料
            2.2.1.2 試驗(yàn)處理
        2.2.2 表觀指標(biāo)的觀察及生理指標(biāo)的測(cè)定
            2.2.2.1 次生病害指數(shù)觀察
            2.2.2.2 果實(shí)失重率的測(cè)定
            2.2.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定
            2.2.2.4 丙二醛MDA含量測(cè)定
            2.2.2.5 活性氧及防御酶活性的測(cè)定
2O₂）含量的測(cè)定">                2.2.2.5.1 過(guò)氧化氫（H₂O₂）含量的測(cè)定
                2.2.2.5.2 CAT活性測(cè)定
                2.2.2.5.3 POD活性測(cè)定
                2.2.2.5.4 SOD活性測(cè)定
                2.2.2.5.5 PPO活性的測(cè)定
2
·?)產(chǎn)生速率的測(cè)定">                2.2.2.5.6 超氧陰離子(O_{2
·?)產(chǎn)生速率的測(cè)定
                2.2.2.5.7 PAL活性的測(cè)定
        2.2.3 主要試劑及儀器設(shè)備
            2.2.3.1 主要試劑
            2.2.3.2 主要儀器設(shè)備
        2.2.4 數(shù)據(jù)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 不同貯藏溫度對(duì)黃瓜采后壽命的影響
        2.3.2 低溫冷害條件下不同貯藏時(shí)間對(duì)采后黃瓜貯藏壽命的影響
        2.3.3 不同濃度MeJA和SNP對(duì)冷藏黃瓜抗冷性的影響
            2.3.3.1 不同濃度MeJA和SNP對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響
            2.3.3.2 不同濃度MeJA和SNP對(duì)失重率的影響
            2.3.3.3 不同濃度MeJA和SNP對(duì)次生病情指數(shù)的影響
        2.3.4 MeJA和SNP處理減輕黃瓜冷害的生理機(jī)理
            2.3.4.1 MeJA和SNP處理對(duì)冷藏黃瓜膜系統(tǒng)的影響
            2.3.4.2 MeJA和SNP處理對(duì)冷藏黃瓜失重率的影響
            2.3.4.3 MeJA和SNP處理對(duì)冷藏黃瓜次生病情指數(shù)的影響
            2.3.4.4 MeJA和SNP處理對(duì)冷藏黃瓜活性氧及防御酶活性的影響
2
·?產(chǎn)生速率的影響">                2.3.4.4.1 對(duì)O2
·?產(chǎn)生速率的影響
2O2含量的影響">                2.3.4.4.2 對(duì)H2O2含量的影響
                2.3.4.4.3 對(duì)CAT活性的影響
                2.3.4.4.4 對(duì)POD活性的影響
                2.3.4.4.5 對(duì)SOD活性的影響
                2.3.4.4.6 對(duì)PPO活性的影響
                2.3.4.4.7 對(duì)PAL活性的影響
    2.4 小結(jié)
2}O₂在MeJA和NO誘導(dǎo)黃瓜抗冷性中的作用">第3章 H₂O₂在MeJA和NO誘導(dǎo)黃瓜抗冷性中的作用
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 供試材料
        3.2.2 試驗(yàn)處理
        3.2.3 表觀指標(biāo)的觀察及生理指標(biāo)的測(cè)定
            3.2.3.1 次生病害指數(shù)觀察
            3.2.3.2 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定
            3.2.3.3 活性氧及防御酶活性的測(cè)定
2O₂）含量的測(cè)定">                3.2.3.3.1 過(guò)氧化氫（H₂O₂）含量的測(cè)定
                3.2.3.3.2 CAT活性測(cè)定
        3.2.4 黃瓜CsCAT1、CsCAT3表達(dá)檢測(cè)
            3.2.4.1 黃瓜果皮總RNA的提取
            3.2.4.2 總RNA濃度的測(cè)定及完整性檢測(cè)
            3.2.4.3 總RNA的純化及檢測(cè)
            3.2.4.4 cDNA第一鏈的合成
            3.2.4.5 熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)和篩選
        3.2.5 黃瓜果皮蛋白樣品的制備與Western blot
            3.2.5.1 黃瓜果皮總蛋白的提取
            3.2.5.2 蛋白定量
            3.2.5.3 電泳
            3.2.5.4 染色和脫色
            3.2.5.5 Western blot雜交步驟
            3.2.5.6 制備黃瓜CsCAT3蛋白抗體
                3.2.5.6.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
                3.2.5.6.2 蛋白的表達(dá)及可溶性分析
                3.2.5.6.3 將構(gòu)建好的重組載體交由杭州華安生物技術(shù)有限公司制備抗體
        3.2.6 主要試劑及儀器設(shè)備
            3.2.6.1 主要試劑
            3.2.6.2 主要儀器設(shè)備
        3.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 DPI及其與MeJA或NO結(jié)合處理對(duì)冷藏黃瓜相對(duì)電導(dǎo)率的影響
        3.3.2 DPI及其與MeJA或NO結(jié)合處理對(duì)冷藏黃瓜次生病情指數(shù)的影響
2O₂含量的影響">        3.3.3 DPI及其與MeJA或NO結(jié)合處理對(duì)冷藏黃瓜H₂O₂含量的影響
        3.3.4 DPI及其與MeJA或NO結(jié)合處理對(duì)冷藏黃瓜CAT活性的影響
        3.3.5 DPI及其與MeJA或NO結(jié)合處理對(duì)冷藏黃瓜CsCAT1表達(dá)的影響
        3.3.6 DPI及其與MeJA或NO結(jié)合處理對(duì)冷藏黃瓜CsCAT3表達(dá)的影響
        3.3.7 黃瓜CAT3抗體的制備
            3.3.7.1 分離CsCAT3基因
            3.3.7.2 重組載體雙酶切
2O₂的關(guān)系">            3.3.7.3 MeJA和NO對(duì)冷藏黃瓜CsCAT3蛋白表達(dá)的影響及其與H₂O₂的關(guān)系
    3.4 小結(jié)
第4章 MeJA和NO在誘導(dǎo)黃瓜抗冷性中的相互作用關(guān)系
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 供試材料
        4.2.2 試驗(yàn)處理
        4.2.3 表觀指標(biāo)的觀察及生理指標(biāo)的測(cè)定
            4.2.3.1 次生病害指數(shù)觀察
            4.2.3.2 果實(shí)失重率的測(cè)定
            4.2.3.3 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定
            4.2.3.4 丙二醛MDA含量測(cè)定
            4.2.3.5 活性氧及防御酶活性的測(cè)定
2O₂）含量的測(cè)定">                4.2.3.5.1 過(guò)氧化氫（H₂O₂）含量的測(cè)定
                4.2.3.5.2 CAT活性測(cè)定
                4.2.3.5.3 POD活性測(cè)定
                4.2.3.5.4 SOD活性測(cè)定
                4.2.3.5.5 PPO活性測(cè)定
2
·?)產(chǎn)生速率的測(cè)定">                4.2.3.5.6 超氧陰離子(O_{2
·?)產(chǎn)生速率的測(cè)定
                4.2.3.5.7 PAL活性測(cè)定
        4.2.4 黃瓜CsCAT1、CsCAT3表達(dá)檢測(cè)
        4.2.5 主要試劑及儀器設(shè)備
            4.2.5.1 主要試劑
            4.2.5.2 儀器設(shè)備
        4.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 MeJA和NO生物合成抑制劑對(duì)MeJA和NO誘導(dǎo)黃瓜抗冷性的影響
            4.3.1.1 對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響
            4.3.1.2 對(duì)失重率的影響
            4.3.1.3 對(duì)次生病情指數(shù)的影響
            4.3.1.4 對(duì)丙二醛含量的影響
        4.3.2 抑制MeJA和NO的生物合成對(duì)MeJA和NO激活黃瓜抗氧化防御酶系統(tǒng)的影響
2
·?產(chǎn)生速率的影響">            4.3.2.1 對(duì)O2
·?產(chǎn)生速率的影響
2O2含量的影響">            4.3.2.2 對(duì)H2O2含量的影響
            4.3.2.3 對(duì)CAT活性的影響
            4.3.2.4 對(duì)POD活性的影響
            4.3.2.5 對(duì)SOD活性的影響
            4.3.2.6 對(duì)PPO活性的影響
            4.3.2.7 對(duì)PAL活性的影響
            4.3.2.8 對(duì)黃瓜CAT1表達(dá)的影響
            4.3.2.9 對(duì)黃瓜CAT3表達(dá)的影響
    4.4 小結(jié)
第5章 MeJA和NO處理黃瓜后的轉(zhuǎn)錄組分析
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 試驗(yàn)材料
        5.2.2 試驗(yàn)處理
        5.2.3 測(cè)序建庫(kù)流程
            5.2.3.1 黃瓜果皮總RNA提取
            5.2.3.2 文庫(kù)構(gòu)建
            5.2.3.3 庫(kù)檢
            5.2.3.4 上機(jī)測(cè)序
        5.2.4 生物信息分析流程
            5.2.4.1 原始序列數(shù)據(jù)
            5.2.4.2 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估
                5.2.4.2.1 測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查
                5.2.4.2.2 A/T/C/G含量分布檢查
                5.2.4.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾
            5.2.4.3 參考序列比對(duì)分析
                5.2.4.3.1 Reads在參考基因組不同區(qū)域的分布情況
                5.2.4.3.2 Reads在染色體上的密度分布情況
            5.2.4.4 可變剪切分析
            5.2.4.5 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)
            5.2.4.6 SNP和lnDel分析
            5.2.4.7 基因表達(dá)水平分析
            5.2.4.8 RNA-seq整體質(zhì)量評(píng)估
                5.2.4.8.1 表達(dá)水平的飽和曲線檢查
                5.2.4.8.2 均一性分布檢查
            5.2.4.9 差異表達(dá)水平
                5.2.4.9.1 基因表達(dá)水平對(duì)比
                5.2.4.9.2 差異基因列表
                5.2.4.9.3 差異表達(dá)基因篩選
                5.2.4.9.4 差異基因聚類分析
                5.2.4.9.5 差異基因韋恩圖
            5.2.4.10 差異基因GO富集分析
            5.2.4.11 差異基因KEGG富集分析
                5.2.4.11.1 差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖
        5.2.5 相關(guān)基因qRT-PCR驗(yàn)證
        5.2.6 主要試劑及儀器設(shè)備
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 黃瓜果皮組織總RNA質(zhì)量檢測(cè)
        5.3.2 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估
        5.3.3 參考序列比對(duì)分析
            5.3.3.1 Reads與參考基因組比對(duì)情況
            5.3.3.2 Reads在參考基因組不同區(qū)域的分布情況
            5.3.3.3 Reads在染色體上的密度分布情況
        5.3.4 可變剪切（alternative splicing，AS）分析
        5.3.5 基因表達(dá)水平分析
        5.3.6 RNA-seq整體質(zhì)量評(píng)估
        5.3.7 差異基因表達(dá)分析
        5.3.8 差異基因GO富集分析
        5.3.9 差異基因KEGG富集分析
        5.3.10 差異基因表達(dá)驗(yàn)證
    5.4 小結(jié)
第6章 超表達(dá)CsCAT3的擬南芥植株對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 植物材料
        6.2.2 試驗(yàn)處理
        6.2.3 試驗(yàn)方法
            6.2.3.1 黃瓜過(guò)氧化氫酶（Catalase3）基因的克隆與功能分析
            6.2.3.2 pCAMBIA2300-CsCAT3基因超表達(dá)重組載體構(gòu)建
            6.2.3.3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞）
            6.2.3.4 擬南芥的栽培和轉(zhuǎn)化
            6.2.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的篩選
            6.2.3.6 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)
            6.2.3.7 基因表達(dá)水平檢測(cè)
        6.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定
            6.2.4.1 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定
2}O₂、O2
·?含量及細(xì)胞死亡">            6.2.4.2 組織化學(xué)染色法檢測(cè)H₂O₂、O_{2
·?含量及細(xì)胞死亡
            6.2.4.3 擬南芥CAT活性測(cè)定
        6.2.5 主要試劑及儀器設(shè)備
        6.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 CsCAT3生物信息學(xué)分析
            6.3.1.1 CsCAT3序列分析
            6.3.1.2 CsCAT3序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
        6.3.2 黃瓜CsCAT3表達(dá)載體構(gòu)建和在擬南芥中表達(dá)
            6.3.2.1 重組載體構(gòu)建
            6.3.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選
            6.3.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株T3代PCR檢測(cè)
        6.3.3 超表達(dá)CsCAT3的擬南芥植株對(duì)低溫的反應(yīng)
            6.3.3.1 低溫脅迫對(duì)擬南芥葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響
            6.3.3.2 低溫脅迫對(duì)擬南芥葉片活性氧水平及細(xì)胞活性的影響
            6.3.3.3 低溫脅迫對(duì)擬南芥CAT活性的影響
            6.3.3.4 低溫脅迫對(duì)擬南芥相關(guān)基因表達(dá)的影響
    6.4 小結(jié)
第7章 討論
    7.1 MeJA或NO處理對(duì)采后黃瓜抗氧化防御系統(tǒng)的影響及其與抗冷性的關(guān)系
2}O₂在MeJA、NO誘導(dǎo)黃瓜抗冷性的生理機(jī)制">    7.2 H₂O₂在MeJA、NO誘導(dǎo)黃瓜抗冷性的生理機(jī)制
    7.3 CAT在MeJA和NO誘導(dǎo)采后黃瓜抗冷性中的作用
    7.4 MeJA和NO在誘導(dǎo)黃瓜抗氧化系統(tǒng)和抗冷性中的作用及其相互關(guān)系
全文結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄A DPI及其與MeJA、SNP結(jié)合處理對(duì)冷藏黃瓜抗冷性的影響
    附圖B 抑制內(nèi)源JA和NO的合成對(duì)NO和MeJA誘導(dǎo)黃瓜抗冷性的影響
    附錄C 攻讀博士期間取得的科研成果



本文編號(hào)：3150524

boshi