發(fā)布時間：2020-10-31 03:43

　　 高羊茅是耐熱性最強的冷季型草坪草之一,在氣候過渡地帶得到了廣泛的種植,發(fā)掘高羊茅耐熱相關基因對提高冷季型草坪草耐熱性有重要的意義。另外,熱激轉錄因子在植物中被廣泛研究,并且普遍在耐熱性中發(fā)揮重要作用,但是對于熱激轉錄因子C類基因的功能研究卻很少。對高羊茅C類熱激轉錄因子進行研究十分有意義。本研究從高羊茅中克隆出一個C類Hsf:FaHsC1b,通過序列分析、亞細胞定位并在擬南芥中過表達來分析FaHsfC1b在不同非生物脅迫下的表達模式以及它對轉基因擬南芥耐熱性的影響,研究結果如下:1以OsHsfC1b(XP_015633152)為搜索請求,從高羊茅轉錄組數(shù)據庫中獲得一段1333 bp的核苷酸序列,經FGENESH程序預測,其開放閱讀框(ORF)為744 bp,編碼247個氨基酸。通過降落聚合酶鏈式反應(touch down PCR)技術擴增獲得其全長編碼序列,由序列比對和系統(tǒng)進化樹分析可知該基因與其他物種中的HsfC1b有較高的相似度,故將此基因命名為高羊茅HsfC1b基因(FaHsfC1b,NCBI登錄號為KY475613)。該基因具備C類Hsfs的基本結構,包括一個DNA結合區(qū)域、一個疏水的寡聚化結構域、一個核定位信號結構域。2構建了 FaHsfC1b-eGFP重組質粒,轉入到擬南芥原生質體中觀察到綠色熒光蛋白信號與DAPI(指示細胞核)信號完全重疊;同時,轉基因擬南芥根尖細胞中也觀察到相同的重疊情況,這說明FaHsfC1b蛋白定位在細胞核中。3對高羊茅進行非生物脅迫處理,結果顯示FaHsyC1b表達量在熱處理(45℃)、冷處理(4℃)、滲透脅迫處理(20%PEG-6000)、鹽處理(150 mMNaCl)下均在48 h內顯著提高。在熱處理下葉片中FaHsfC1b在處理1 h即達到最高值,為對照的40倍,根部FaHsfC1b表達量在4 h開始緩慢攀升,最后在48 h達到最大值。4構建了 pEarleyGate103-FaHsfC1b表達載體并轉入擬南芥,通過草銨膦篩選和PCR鑒定,得到20個陽性轉基因株系。對平板中野生型(WT)和轉基因株系進行高溫(45℃)處理,根據存活率篩選出4個穩(wěn)定的抗性株系,即株系5,株系6,株系16,和株系17。在FaHsfC1b過表達株系中檢測到較高的FaHsfC1b表達量,而WT中則未檢測到FaHsfC1b的表達。同時,這幾個轉基因株系在冷脅迫、滲透脅迫、鹽脅迫下與WT無差異,在非脅迫條件下轉基因株系的長勢也與WT無異。5在熱處理下,FaHsfC1b過表達植株比WT有更少的枯萎葉片,在恢復后葉片枯黃率更低。經檢測,過表達株系光化學效率和葉綠素含量比WT更高,電解質滲漏率則比WT低,這說明過量表達FaHsfC1b可以將轉基因擬南芥的代謝平衡和細胞膜穩(wěn)定性維持在較高水平,從而提高轉基因擬南芥耐熱性。6熱處理1 h后,通過DAB和NBT實驗得知FaHsfC1b過表達植株葉片中ROS含量明顯低于WT,說明轉基因擬南芥在熱處理下受到了較小的傷害。7 37℃ 熱處理 1h 后,AtHHsp1 8.1-CI,AtHsp22.0-ER,AtHHsp26.5-P(r)和 AtHHsp70b基因的表達量在兩個FaHsfC1b過表達株系(株系6和株系16)和WT株系中都顯著提高,但過表達植株中表達量上升幅度更大。說明熱激蛋白在轉基因擬南芥植株耐熱性中發(fā)揮了更好的作用。綜上所述,從高羊茅中克隆到的C類熱激轉錄因子FaHsfC1b定位于細胞核,響應熱脅迫、冷脅迫、滲透脅迫以及鹽脅迫。通過轉化模式植物擬南芥,初步確定該基因通過對生理生化及下游基因的表達調控,提高植物耐熱性。該研究為培育耐熱草坪草新種質提供了基因資源。
【學位單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S688.4
【部分圖文】：

２．２．３?ＦａＨｓｆＣｌｂ序歹丨此對和系統(tǒng)進化樹分析??采用ＭＥＧＡ?５．１進行系統(tǒng)進化樹分析表明，ＦａＨｓｆＣｌｂ與小麥、二穗短柄草、水稻、??玉米、粟（５Ｗｆｉｒｒ／ａ／／ａ／／ｃａ）中的ＨｓｆＣｌｂ都有較高的同源性（圖２－３）。故將此基因命??名為高羊茅基因。并己在ＮＣＢＩ上進行注冊，基因登錄號為ＫＹ４７５６１３。根??據Ｂｉｏｅｄｉｔ軟件氨基酸序列比對結果（圖２－４）可知，該基因在靠近Ｎ端的部分有一個??ＤＮＡ結合區(qū)域（ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，?ＤＢＤ），緊接著是一個疏水的寡聚化結構域??（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｄｏｍａｉｎ，?０Ｄ），也叫作ＨＲ－Ａ／Ｂ區(qū)域，靠近Ｃ端是核定位信號結構??域（ｎｕｃｌｅａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ，?ＮＬＳ）。??６２??？?ＦａＨＳＦＣＩｂ??９８?［Ｉ?ＴａＨＳＦＣＩｂ??４１Ｊ?Ｉ?ＢｄＨＳＦＣＩｂ???１?００?１?ＯｓＨＳＦＣＩｂ???ＺｍＨＳＦ３０????５ｇ１?ＳｉＨＳＦＣＩｂ???ＯｓＨＳＦＣＩａ???ＯｓＨＳＦＣ２ａ??，〇〇??ＯｓＨＳＦＣ２ｂ??圖２－３?ＦａＨｓｆＣｌｂ與其他Ｃ類熱激轉錄因子的系統(tǒng)進化樹分析??Ｆｉｇ．?２－３?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?ＨＳＦＣ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??２５??

?Ｍａｒｋｅｒ??圖２－２高羊茅片段凝膠電泳圖??Ｆｉｇ．?２－２?Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ｆｒｏｍ?ｔａｌｌ?ｆｅｓｃｕｅ??將上述克隆到的基因連接ｐＪＥＴｌ．２?ｂｌｕｎｔ?ｖｅｃｔｏｒ并用電擊法轉入大腸桿菌，將菌液??送測序公司確認目的片段序列。該片段ＯＲＦ全長７４４?ｂｐ，編碼２４７個氨基酸，與之??前預測所得完全符合。??２．２．３?ＦａＨｓｆＣｌｂ序歹丨此對和系統(tǒng)進化樹分析??采用ＭＥＧＡ?５．１進行系統(tǒng)進化樹分析表明，ＦａＨｓｆＣｌｂ與小麥、二穗短柄草、水稻、??玉米、粟（５Ｗｆｉｒｒ／ａ／／ａ／／ｃａ）中的ＨｓｆＣｌｂ都有較高的同源性（圖２－３）。故將此基因命??名為高羊茅基因。并己在ＮＣＢＩ上進行注冊，基因登錄號為ＫＹ４７５６１３。根??據Ｂｉｏｅｄｉｔ軟件氨基酸序列比對結果（圖２－４）可知，該基因在靠近Ｎ端的部分有一個??ＤＮＡ結合區(qū)域（ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，?ＤＢＤ），緊接著是一個疏水的寡聚化結構域??（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｄｏｍａｉｎ，?０Ｄ），也叫作ＨＲ－Ａ／Ｂ區(qū)域，靠近Ｃ端是核定位信號結構??域（ｎｕｃｌｅａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ

尖部分制作玻片，于共聚焦顯微鏡下觀察，即可看到ＧＦＰ信號，再用ＤＡＰＩ染色液滴??入盛有根尖的載玻片，在顯微鏡下觀察細胞核的位置，與ＧＦＰ信號比對后兩者完全重??合（如圖２－６），再次證明了?ＦａＨｓｆＣｌｂ的核定位。??ＧＦＰ?ＤＡＰＩ?Ｂｒｉｑｈｔ?ｆｉｅｌｄ?Ｍｅｒｑｅｄ??ｍｍ：：＇、：??圖２－６乃＆尸轉基因擬南芥ＦａＨｓｆＣｌｂ蛋白在根毛上的核定位??Ｆｉｇ．?２－６?Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?ｒｏｏｔ?ｈａｉｒ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ．??在高倍放大鏡下觀察到的擬南芥根毛ＧＦＰ信號、細胞核與ＧＦＰ信號重疊情況。Ｂａｒ＝１０Ｍｍ。??Ｔｈｒｅｅ－ｄａｙ－ｏｌｄ?ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ?ｉｎ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｄｉｓｈ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｈｉｇｈｅｒ?ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．??Ｂａｒ＝１０?（ｉｍ．??２．２．５?在非生物肋、迫下的表達分析??將水培培養(yǎng)２周左右的高羊茅植株在４５°Ｃ、４°Ｃ、２０?％?ＰＥＧ－６０００及１５０?ｍＭ?ＮａＣｌ??條件分別處理４８ｈ，在Ｏｈ、ｌｈ、２ｈ、４ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ取樣，提取總ＲＮＡ后，??反轉錄成單鏈ｃＤＮＡ。通過ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測在各種非生物脅迫下的表達情況，??以作為內參基因。ｑＲＴ－ＰＣＲ結果如圖２－７所示，表達量在缺水處??理、鹽處理、熱處理、冷處理下均在４８?ｈ內顯著提高，從的表達模式因不同??處理、不同組織部位而不同。??在熱處理和冷處理下，高羊茅葉片中Ａ／＊／Ｃ乃比根部更早表現(xiàn)出表達??量的激增
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本文編號：2863401