【摘要】：隨著全球環(huán)境氣候的變化以及工業(yè)化和城市化程度的提高,南方土壤酸化加劇,對植物的生長造成了很大的危害,對人類生存環(huán)境和生活品質(zhì)產(chǎn)生了很大影響。培育抗鋁的植物品種并應(yīng)用到生產(chǎn)生活中是一種比較直接的方法,并且具有生態(tài)、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢。日本結(jié)縷草是一種優(yōu)良的暖季型草坪草,廣泛生長在南北方的廣大地區(qū),它能在含鋁量比較高的酸化土壤中生長良好,是一種耐鋁的植物。為了揭示日本結(jié)縷草耐鋁的分子機制,本研究對日本結(jié)縷草鋁脅迫下響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析,在此基礎(chǔ)上研究了日本結(jié)縷草ZjOMT基因的序列和功能特征,并在大腸桿菌和擬南芥中進(jìn)行表達(dá)。主要結(jié)果如下:(1)日本結(jié)縷草鋁響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組分析通過鋁處理和未處理的日本結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了 34,743個Unigenes,其中14,555個為差異表達(dá)基因,包括4,845個下調(diào)基因和9,710個上調(diào)基因。差異表達(dá)基因中93.17%的基因為已知基因,其中314個基因尚未被注釋,已經(jīng)被注釋的的基因中,包含大量的轉(zhuǎn)運蛋白基因、轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白基因、離子通道蛋白基因、參與氧化還原反應(yīng)的基因、以及參與果膠合成、檸檬酸合成等抗鋁相關(guān)的基因。新基因中與離子結(jié)合相關(guān)的XLOC_007305、XLOC_010540、XLOC_03748在鋁脅迫過程中表達(dá)量明顯提高。KEGG富集顯示:在鋁脅迫下,日本結(jié)縷草中糖酵解途徑、抗壞血酸和代謝、氧化磷酸化、光合作用和脂肪酸生物合成與鋁脅迫響應(yīng)較為密切。(2)日本結(jié)縷草ZjOMT基因克隆及表達(dá)分析從日本結(jié)縷草中克隆了一個甲基轉(zhuǎn)移酶基因ZjOMT。ZjOMT編碼序列為1080bp,編碼蛋白序列包含359個氨基酸。鋁脅迫下,ZjOMT在葉和根中的表達(dá)量上調(diào)可達(dá)20.86倍和31.18倍。(3)日本結(jié)縷草ZjOMT基因功能研究將ZjOMT蛋白基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),大腸桿菌的褪黑素合成能力提高了8倍,并且重組載體的鋁抗性顯著提高。將ZjOMT基因進(jìn)一步轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行過量表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株的褪黑素含量明顯上升,3個過量表達(dá)ZjOMT基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系褪黑素含量最高達(dá)72 ng/g,為野生型的4.0倍。另外兩個株系也分別高達(dá)3.2倍和2.7倍。轉(zhuǎn)基因植株的根長在200μM氯化鋁脅迫下比對照分別減少了 20%、35%和37%,而野生型的根伸長減少60%,野生型擬南芥遭受氯化鋁毒害,根長僅為過量表達(dá)ZjOMT基因株系的57-78%,轉(zhuǎn)基因株系在200 μM氯化鋁脅迫下MDA含量分別為野生型含量的81.1%、73.5%、64.4%,過量表達(dá)ZjOMT基因的擬南芥抗鋁性顯著提高。ZjOMT基因的表達(dá)可以提高植物褪黑素含量,進(jìn)而提高抗鋁毒能力,ZjOMT既可以作為提高作物褪黑素含量的候選基因,也可作為植物抗鋁毒基因工程的基因資源。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S688.4
【圖文】：

逑ｍｇ／ｋｇ，ＭＤＡ含量、ＣＡＴ和ＰＯＤ酶活力顯著高于對照，達(dá)到極顯著水平（Ｐ＜０．０１），逡逑葉綠素含量雖有下降但未達(dá)極顯著水平（圖２－１）。逡逑豸邋３１邐１５－１邐Ｂ逡逑§邐＞邐ＡＢ逡逑ｆ邋２＇４＇邋Ｔ邋Ｔ邋Ｔ邋Ａ邋Ａ邐１２＇邋Ａ邋Ａ邐＾邋Ｉ逡逑—邋ｉ邋＃邐Ｔ邋ｒ邋Ａ邐0邋Ｔ邋Ｔ邋Ａ邋Ｉ逡逑Ｉ邐１．８－上邐ｉ邐N邐Ｉ邐Ｉ邐Ｅ邐９．邋ｉ邋N邋＊逡逑１邐ｉ逡逑２邐１．２．邐｜邐６－逡逑Ｉ邐８逡逑！邐０．６－邐ｇ邐３＿逡逑５邐２逡逑０邐邐ｙ邐邋■邐：邋．：■邐ｋ邐．．．．．：－邐＾邐．：邐，邐：邐．邐■邐Ｑ邐＾逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０邐１００邐０邐２０邐４０邐６０邐８０邐１００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｌ＞邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋（ｍｇ／ｋｇ邋ｓｏｉｌ）邐Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｂ－＊－邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋（ｍｇ／ｋｇ邋ｓｏｉｌ）逡逑Ｓ＇邐６００－ｊ邐５邐１６５００邐！逡逑ｉ邐ｕ．邐Ｂ逡逑Ｏ）邐ｇ邐0ｉ邐丫逡逑塞邐５６０邋－邐Ｉ邐１３２００邐－邋？邋N逡逑ＡＢ邐ｉ邐１邐Ａ邐ａ邐Ａ逡逑Ｉ邐５２°＊邐Ａ邐Ａ邐Ａ邐＾邐Ｉ邐｜邐＂°°－邐ｔ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑＜ｉ邐Ｔ邐：暴邐ｍ邐＿邐呡邐＜３逡逑５邋４８０邋－上邋＊邐５邐６６００邋－逡逑＾邐Ｓ逡逑ｆ邋４４０邋－邐ｆ邋３３００－逡逑導(dǎo)邐１逡逑ｈ－邋４００邐邐邐邐邐．邐．邐，邐．邋Ｑ邋０－１邐，邐，邐，邐，邐，邐

我們利用ＦＤＲ與ｌｏｇ２ＦＣ來篩選差異基因，篩選條件為ＦＤＲ＜０．０５且ｌ0ｇ２ＦＣ＞ｌ，逡逑經(jīng)過鋁脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)差異基因丨４，５５５個，上調(diào)的有９，７１０個，下調(diào)基因４，８４５個，逡逑（圖２－２）。通過鋁脅迫處理和對照之間的分析和比較，部分基因表達(dá)發(fā)生了變化，逡逑正因為這些基因的差異表達(dá)賦予了日本結(jié)縷草鋁脅迫的抗性。逡逑Ｓｃａｔｔｅｒ邋ｐｌｏｔ逡逑ｐｅａｒｓｏｎ邋ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ：邋０．７１６逡逑？邐ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邋（９７１０）逡逑＿邋ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邋（４８４５）邐＃邋■暴逡逑0邋？邋ｎｏｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋（２０１８８）邐＾逡逑ｒ逡逑？邐％邋？邋？逡逑ＣＯ逡逑９）逡逑產(chǎn)邐Ｌ＂！邐１邐１邐１邐逡逑１0－０３邐１ｅ－０１邐１？＋０１邐１ｅ＋０３逡逑Ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ＣＫ逡逑圖２－２差異基因散點圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｓｃａｔｔｅｒ邋ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ逡逑表２－３列舉了邋９９４個新基因中的１６個表達(dá)量較高的差異表達(dá)基因，鋁脅迫處理逡逑３１逡逑

我們選取了邋４個下調(diào)已注釋基因、４個上調(diào)已注釋基因和４個未注析基因共１２逡逑個基因?qū)︿X脅迫后不同時間段進(jìn)行了邋ｑ－ＰＣＲ熒光定量分析，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)逡逑果相一致（圖２－５）。其中兩基因Ｆ調(diào)表達(dá)后有所逡逑回升似／ｖｅ邋ｆｒａｒａｃｎ沖基因下調(diào)較明顯，而逡逑基因下調(diào)趨勢較緩。上調(diào)己注釋基因中，過氧化物酶（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ）、應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白逡逑（ｓｔｒｅｓｓ邋ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ）、鋅指蛋白（ｚｉｎｃ邋ｆｉｎｇｅｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ）基因基本逐步上調(diào)，而逡逑基因先升后降最終略高于未處理。新基因中跟水解酶相關(guān)的逡逑ＸＬＯＣ＿０００３６５、與陽離子結(jié)合相關(guān)的ＸＬＯＣ＿００６０７３都逐漸下調(diào)，與金屬離子結(jié)合的逡逑ＸＬＯＣ＿０１０５４０基因穩(wěn)步上調(diào)，而與金屬簇結(jié)合相關(guān)的ＸＬＯＣ＿０３７４８６基因先上調(diào)后逡逑緩慢回落。在鋁脅迫植物的整個過程中，許許多多基因參與其中，其表達(dá)模式也多種逡逑多樣，有的在作用通路中形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)，與其他基因共同形成動態(tài)平衡，無論基因逡逑的表達(dá)模式如何

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