【摘要】：水通道蛋白在介導植物體內水分的運輸、維持水分平衡,調節(jié)細胞內外的滲透平衡及應對各種非生物脅迫中起著極其重要的作用。中國西南喀斯特山區(qū)的野生毛葡萄(Vitis quinquangularis),經過長期的干旱-復水-再干旱模式的馴化,形成特有的抗旱性。為了探究喀斯特地區(qū)野生毛葡萄液泡膜水通道蛋白的結構特征,及其在干旱脅迫中所發(fā)揮的作用,本研究以極抗旱的野生毛葡萄‘花溪-9’為研究對象,不抗旱的歐洲葡萄(V.vinifera)‘紅地球’為對照組材料,利用同源序列分析及RT-PCR的方法克隆得到野生毛葡萄的液泡膜水通道蛋白(TIPs)基因全長,分析了各基因的生物信息學特征、不同組織中及土壤干旱-復水條件下各基因的表達規(guī)律,研究了基因表達與水分脅迫生理指標的相關性關系,全面探究TIPs基因與野生毛葡萄抗旱性的關系,構建了基因表達載體,并成功將VhTIP2;1導入擬南芥進行了部分功能驗證。主要取得以下研究結果:1.利用同源序列分析及RT-PCR法從‘花溪-9’中克隆出9個液泡膜水通道蛋白基因(VhTIP)的全長cDNA序列。9個TIP基因分別命名為:VhTIP1;1(KY379060)、VhTIP1;2(KY379061)、VhTIP1;3(KY391793)、VhTIP1;4(KY391794)、VhTIP2;1(KP276237)、VhTIP2;2(KY379062)、VhTIP3;1(KY922959)、VhTIP4;1(KY379063)、VhTIP5;1(KY922960),分別包含756、756、756、759、750、753、780、762、750 bp的完整開放閱讀框。2.經蛋白結構預測,9個VhTIPs氨基酸序列均具有MIP家族信號序列SGGHINPAVT以及兩個NPA(Asn-Pro-Ala)單元,分別編碼251、251、251、252、249、250、259、253、249個氨基酸。將VhTIPs進行理化性質分析發(fā)現這9個VhTIPs的相對分子質量在25.27 kD~27.42 kD之間,理論等電點(pI)在4.96~7.11之間,不穩(wěn)定系數在26.47~35.89之間,均為穩(wěn)定性蛋白。經親水性檢測,VhTIPs蛋白的親水平均數均在0.657~0.923之間,為疏水性蛋白。利用TMHMM-2.0軟件預測了VhTIPs蛋白的跨膜區(qū),除VhTIP1;4含有7個跨膜區(qū)外,其他8個均含有6個跨膜結構。利用SignalP3.0 Server對VhTIPs進行信號肽預測,9個VhTIPs蛋白均無信號肽。利用Plant-mPLoc在線軟件對這9個基因進行亞細胞定位,均定位在液泡膜上。3.組織特異性表達分析發(fā)現9個TIP基因中的TIP1;4、TIP2;1、TIP2;2及TIP4;1在極抗旱的野生毛葡萄‘花溪-9’和不抗旱的歐洲葡萄‘紅地球’的根中表達量均最高,且在‘花溪-9’中的表達量高于‘紅地球’的,可能與根部水分運輸、根壓的調節(jié)及抗旱性的強弱相關,TIP1;4及TIP2;2只在根中特異表達,莖和葉中幾乎檢測不到,說明此基因主要作用于根部的水分運輸。TIP1;2在‘花溪-9’葉中的表達量最高,莖中次之,根中最少,但在‘紅地球’的根莖葉中幾乎沒有表達量,預測該基因可能參與了‘花溪-9’抗旱性調節(jié);TIP1;3在‘花溪-9’和‘紅地球’中的葉中表達量最高,根中檢測不到其表達量,可能主要參與葉片的水分轉運。4.在干旱脅迫過程中,‘花溪-9’根中VhTIP1;1和VhTIP5;1基因表達呈現先升高后降低的變化趨勢,VhTIP1;2和VhTIP2;1呈先降低后升高趨勢;復水7d后VhTIP1;1、VhTIP2;1、VhTIP3;1、VhTIP4;1和VhTIP5;1表達量恢復到對照水平;‘紅地球’根中VvTIP1;4和VvTIP5;1基因也能恢復到對照水平。在莖中,‘花溪-9’的VhTIP5;1以及‘紅地球’的VvTIP2;2可恢復至對照水平。‘花溪-9’葉中的VhTIP1;3和VhTIP1;4及‘紅地球’的VvTIP2;1也可恢復至對照水平。5.干旱脅迫下,光合參數(凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率)、葉水勢、葉片相對含水量和水力結構參數(導水率、葉比導率和比導率)會隨著干旱脅迫時間的延長逐漸降低,根、莖和葉的質膜相對透性逐漸增大,細胞膜的通透性變大,穩(wěn)定性逐漸降低;復水后,各指標基本能恢復到正常水平。干旱-復水條件下9個VhTIP基因的表達量與各生理指標相關性分析表明,在‘花溪-9’葉片中,各生理指標與VhTIP1;1、VhTIP1;2、VhTIP2;2、VhTIP4;1和VhTIP5;1基因的表達量呈正相關,在‘紅地球’葉片中,各生理指標與VvTIP1;3和VvTIP2;1的表達量呈正相關,其中VvTIP2;1達到顯著正相關,與VvTIP1;1、VvTIP1;4和VvTIP3;1基因的表達量呈負相關。TIP1;2和TIP2;1在2份材料間響應干旱逆境的差異最大。6.成功構建了植物表達載體pBI121-35S-Vh TIP2;1,利用農桿菌介導與花絮浸漬(噴霧)法相結合將VhTIP2;1成功導入擬南芥,且超量表達VhTIP2;1基因的T4代擬南芥植株的干旱脅迫耐性遠高于野生型擬南芥,說明VhTIP2;1基因在野生毛葡萄‘花溪-9’抵御干旱脅迫過程中起到重要作用。
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S663.1
【圖文】：

基酸序列拓撲學及三維結構分析表明此四聚體結構對蛋白質的結構穩(wěn)定和功能行使的正確性具有重要作用（張璐 等，2014）。圖1 水通道蛋白的結構模型Fig. 1 Model of the structure of an AQP引自張璐等（2014）文獻。a 圖中圓柱形代表 - 螺旋（TM1~ TM6），被5個環(huán)（A~ E）所連接。2個螺旋域分別有一半從相對的方向插入細胞質中，構成了水通道蛋白的核心。B環(huán)和E環(huán)具有高度保守的NPA殘基。b 圖中紅色部分表示植物水通道蛋白的NPA結構。1.2.1.3 水通道蛋白的分類目前，已在多種植物中分離出水通道蛋白基因。在模式植物擬南芥（Chaumont etal.，2000）、水稻（Johanson et al.，2001）、玉米（Sakurai et al.，2005）、歐洲葡萄（Rebecca et al.，2009）、辣椒（陳儒鋼 等

圖 2 導水率測定裝置示意圖2 Schematic diagram of the apparatus for measuring hydraulic condu萄 VhTIPs 基因的表達模式分析中的表達模式壤干旱脅迫的‘花溪 9’和‘紅地球’的根、莖、葉的 光定量 PCR 儀，進行 VhTIPs 的表達分析。以葡萄 Ub）作為內參，以Ubiquitin-A和Ubiquitin-S（表8）為內參引物，反應體系為 20 μL。反應體系及程序參照 SYBR Plus）試劑盒說明書。表 7 Real-time PCR 反應體系Table 7 Real-time PCR reaction systemtion mixture 用量 Consumption 終濃

【參考文獻】

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本文編號：2742467