【摘要】：黃瓜(Cucumis sativusL.)是一種重要的園藝作物,黃瓜的生長對水分需求量大,對水分匿缺敏感。干旱脅迫會導致黃瓜產(chǎn)量下降,造成經(jīng)濟損失。目前,關(guān)于黃瓜抵御干旱脅迫的研究多處于生理研究層面,黃瓜響應干旱脅迫的分子機制研究較少。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應干旱脅迫機制中具有十分重要的作用,而黃瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子響應干旱脅迫的分子機制尚不明確。本研究以黃瓜為實驗材料,同源克隆得到黃瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子CsATAF1,并對CsATAF1進行功能驗證,探討CsATAF1參與植株抗旱性調(diào)節(jié)的分子機制,為揭示黃瓜抵御干旱脅迫的分子機制提供了一定的研究基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.同源克隆得到黃瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子CsATAF1,在N端具有一個NAC轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域,C端高度變異。該基因與擬南芥ATAF1基因的親緣關(guān)系最近,因此命名為CsATAF1。亞細胞定位結(jié)果顯示,CsATAF1定位于細胞核上。該基因受到不同逆境脅迫的誘導,10%PEG6000模擬干旱處理9小時后,相對正常培養(yǎng)條件下,表達量提升超過四十倍,達到峰值。酵母單雜交結(jié)果顯示,CsATAF1具有轉(zhuǎn)錄激活活性,轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于CsATAF1的C端,其轉(zhuǎn)錄激活活性高于全長,CsATAF1的N端沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。2.在黃瓜中過表達CsATAF1緩解了滲透脅迫對種子萌發(fā)的抑制。過表達植株根的伸長明顯優(yōu)于野生型植株。與野生型植株相比,過表達植株的抗旱性顯著提高。在干旱脅迫條件下,過表達植株葉片的水分散失率和氣孔開度顯著低于野生型植株,表明CsATAF1可能通過調(diào)節(jié)氣孔的開閉,減少了植株水分的散失,使得過表達植株的光合效率顯著的高于野生型植株。干旱脅迫會促進植株體內(nèi)ROS的積累,過表達植株中抗氧化酶的活性提高,活性氧積累減少。過表達植株對ABA的敏感性提高,從而快速誘導氣孔的關(guān)閉,減少水分的散失。在擬南芥中過表達CsATAF1也得到同樣的結(jié)果,干旱處理后轉(zhuǎn)基因植株的存活率顯著提高。在黃瓜中RNA干擾CsATAF1的表達導致干擾植株中抗氧酶活性降低、在干旱脅迫下積累更多的活性氧以及對ABA的敏感性下降,抗旱性顯著降低。3.CsDREB2C,CsCu-ZnSOD,CsABI5 被鑒定為 CsATAF1 的靶基因。qPCR 結(jié)果顯示,正常條件下,CsDREB2C,CsCu-ZnSOD,CsABI5的表達在過表達植株中上升,在干擾植株中的表達量下降。酵母單雜交和凝膠阻滯實驗證明,CsATAF1能夠識別CsDREB2C、CsCu-ZnSOD和CsABI5啟動子上的NAC識別位點并與之結(jié)合。煙草葉片注射和黃瓜原生質(zhì)體瞬時表達實驗證明,CsATAF1能夠激活下游逆境響應基因CsDREB2C,CsCu-ZnSOD,CsABI5的表達。綜上所述,黃瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子CsATAF1作為轉(zhuǎn)錄激活因子參與抗旱性的調(diào)節(jié),提高了轉(zhuǎn)基因植株清除活性氧的能力,并參與ABA信號轉(zhuǎn)導途徑。
【圖文】：

ＮＡＣ蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，擁有兩個銜接重復的ＮＡＣ保守結(jié)構(gòu)域；ＳＯＧ１基因Ｎ端ＮＡＣ保守結(jié)逡逑構(gòu)域前具有一段擴展序列；Ｖ０Ｚ蛋白質(zhì)組成的保守結(jié)構(gòu)域在Ｃ端，而轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域在Ｎ端，如逡逑圖１－４所示網(wǎng)。逡逑…？邋；．．邐＼邐ａｃ＾ｖａｔｗ，邋ｒｅｐｍｓｓｆｏｎ，逡逑ｐ＿ｎ＾ｇ逡逑ｉ邋邐邐邐Ａ邐ＩＩ邋邐邋１邐＞逡逑（０邋Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ邋（邐ｊ邋Ｃ－ｔｅｒｍ？＾ａｌ逡逑寺＾０邋ｍｍｍ邋丨 ＴＲ邋ｄｏｓｒｉａｓｎ邋柳＂逡逑（？ｓ邋ｉ邋ａａ邋ｍｓｓ邋ｍ邋ｉ邋ｉａ邐［］邋ｉ逡逑邐邋ＭＡＣ邋ｄｏｍａｓｎ邐邐餅你ｍsE邐邐逡逑（ＨＤ邐１邋ＷＭｔ邐！；１Ｍ邋Ｉ逡逑邐邋ＮＡＣ邐邐＊＊？－逡逑ｍ邐…—ＢＳＩＦｌｌ逡逑－＊＜■邐邋ＮＡＣ邋ｃｉｏｍａｉｎ邐．奇ＮＡＣ邐邐？＞＊．逡逑（ｖ！邋Ｌ邐二：＇ｌｌ＇邋＇Ｊ—二＂■■邋＂■■邋＿＿邋邐邐邋Ｉ逡逑——邋ＮＡＣ邋ｔｋ＞ｍｍｎ邋邋邋，■邋－＊４—} 邐逡逑（，＊，邋ｉ邐ｎｍ］—ｉｍｉ－ｇｉ逡逑，寺 —了Ｂ邋ｄｏ＊？設(shè)沾——０８０邋邋邋ＮＡＣ邋ｃｋ＞ｍ？ｉｎ邋邋邋邐？■逡逑圖１－４＼八（：蛋白的結(jié)構(gòu)特征［９７］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４．邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＮＡＣ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑１．３．２邐ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能逡逑ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子被報道參與多種生物學功能的調(diào)節(jié)，如參與植物次生生長，在植物衰老過程中逡逑發(fā)揮作用，參與激素的調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導，參與植物體內(nèi)生物應激防御反應，，在非生物脅迫中發(fā)揮逡逑作用。有大量的證據(jù)表明

２．３．２亞細胞定位逡逑利用基因槍介導的洋蔥表皮瞬時轉(zhuǎn)化方法檢測了邋ＣｓＡＴＡＦｌ蛋白的亞細胞定位。結(jié)果表明，逡逑ＣｓＡＴＡＦｌ蛋白定位在細胞核上（圖２－４Ｄ－Ｆ）。對照空載ＧＦＰ蛋白的熒光信號分布在整個細胞（圖２－逡逑４Ａ－Ｃ）。逡逑２０逡逑
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S642.2

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本文編號：2682623