【摘要】：本研究采集四川黃龍溝自然保護(hù)區(qū)西藏構(gòu)蘭(Cypripedium ribeticum),黃花杓蘭(Cypripedium flavum)和無(wú)苞杓蘭(Cypripedium bardolphianm)的根段。用徒手切片法觀察了3種杓蘭的菌根結(jié)構(gòu),并采用菌絲團(tuán)懸浮液小塊培養(yǎng)基、菌根根段組織切塊和菌絲團(tuán)懸浮液涂板3種方法分離根部?jī)?nèi)生真菌,結(jié)合培養(yǎng)形態(tài)觀察和ITS區(qū)段的序列信息對(duì)分離到的菌株進(jìn)行鑒定。通過(guò)物種集中性、Simpson多樣性指數(shù)和.Pielou均勻度指數(shù)計(jì)算三種杓蘭根部?jī)?nèi)生真菌的多樣性。研究主要結(jié)果為:1.西藏杓蘭、黃花杓蘭和無(wú)苞杓蘭的根部?jī)?nèi)生真菌通過(guò)根表皮的外皮層進(jìn)入杓蘭屬植物根部,但沒(méi)有在中髓柱和維管束細(xì)胞區(qū)域觀察到菌絲侵入。2.菌絲團(tuán)懸浮液小塊培養(yǎng)基分離法的分離效果優(yōu)于其它兩種方法。3.三種杓蘭根部分離得到10屬15株內(nèi)生真菌,其中以膠膜菌屬最多,占總體分離種類的33.3%。包括膠膜菌屬(Tulasnella)有5株,瘤菌根菌屬(Epulorhiza)1株,木霉屬(Trichoderma)2株,耙齒菌屬(Irpex)1株,碳團(tuán)菌株(Hypoxylon)1株,赤霉菌屬(Gibberella)1株,鐮刀菌屬(Fusarium)1株,肉座菌屬(Hpocrea)1株,叢赤殼屬(Nectria)1株,黑團(tuán)孢屬(Periconia)1株。分離得到的內(nèi)生真菌種類有差異性,造成這種差異性的原因可能是共生杓蘭生境不同和生長(zhǎng)周期不同。4.黃花杓蘭根部?jī)?nèi)生真菌的多樣性和均勻度在3種杓蘭中最高,其次是西藏杓蘭,最后是無(wú)苞杓蘭。說(shuō)明在這一生長(zhǎng)階段中黃花杓蘭適應(yīng)外界環(huán)境的能力優(yōu)于西藏杓蘭和無(wú)苞杓蘭。
【圖文】：

燒滅菌過(guò)的接種針挑取小塊培養(yǎng)基，迅速接入高壓滅菌的空培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中逡逑放１０個(gè)小塊培養(yǎng)基，每個(gè)小塊培養(yǎng)基之間保持相對(duì)均勻距離，外側(cè)小塊培養(yǎng)基不要逡逑接觸到培養(yǎng)皿內(nèi)壁，直徑９邋ｃｍ的平板大約可以制作３０—４０個(gè)小塊培養(yǎng)基。（圖２－１邋）。逡逑圖２－１培養(yǎng)皿中的小塊培養(yǎng)基逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｓｍａｌｌ邋ｐｉｅｃｅｓ邋ｏｆ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｐｅｔｒｉ邋ｄｉｓｈ逡逑２．邋３．邋１．邋２菌絲團(tuán)懸浮液的制備逡逑在超凈工作臺(tái)上，用酒精燈外焰灼燒滅菌過(guò)的鑷子將三種杓蘭菌根根段夾取到盛逡逑滿７５％酒精的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，完全浸泡３０ｓ后，再用灼燒滅菌過(guò)的鑷子放入１％的逡逑ＮａＣＩＯ溶液中。浸泡３邋ｍｉｎ后夾出，再放入裝滿無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中沖洗５—６次后，逡逑８逡逑

干燥的濾紙上，擦干根段表面水分。用灼燒滅菌過(guò)的手術(shù)刀將根段切成０．１邋—邋０．３邋ｃｍ逡逑的組織切塊，平鋪在２．３．２．１邋ＰＯＡ培養(yǎng)基平板上。每個(gè)培養(yǎng)基平板里按照五角形位置逡逑平鋪５個(gè)組織切塊（圖２－２）。記好分離信息后，放入２５邋°Ｃ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并以沒(méi)逡逑有加入根段組織切塊的ＰＯＡ培養(yǎng)基為對(duì)照組。每天觀察一次，一旦發(fā)現(xiàn)有菌絲從根逡逑段組織組織切塊邊緣長(zhǎng)出，迅速在超凈工作臺(tái)上用灼燒滅菌過(guò)接種針挑取菌絲轉(zhuǎn)移到逡逑培養(yǎng)基平板上（配方見(jiàn)２．３．１．３）進(jìn)行純化培養(yǎng)。并將剩余的ＰＯＡ培養(yǎng)基放回２５°Ｃ逡逑培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)觀察，重復(fù)上述試驗(yàn)，直到?jīng)]有菌絲長(zhǎng)出為止。分離得到菌絲重復(fù)逡逑純化過(guò)程，用ＰＤＡ培養(yǎng)基平板作為純化培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)純化得到單一菌落，用ＰＤＡ逡逑斜面培養(yǎng)保存于４邋°Ｃ冰箱中，作為后續(xù)試驗(yàn)的材料。逡逑■逡逑圖２－２根段組織切片逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｓｌｉｃｅ邋ｏｆ邋ｒｏｏｔ邋ｓｅｇｍｅｎｔｓ逡逑２．邋３．邋３菌絲團(tuán)懸浮液涂板混勻分離法逡逑２．邋３．邋２．邋１分離培養(yǎng)基的制備逡逑配置馬鈴薯燕麥培基（ＰＯＡ），配方為新鮮去皮馬鈴薯５０克，燕麥８克，瓊脂逡逑１７克，蒸餾水１０００毫升，ｐＨ自然，高壓滅菌。冷卻到４６邋°Ｃ附近時(shí)，，按比例依次滴逡逑加入青霉素和鏈霉素
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S682.31

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本文編號(hào)：2645254