【摘要】：梨輪紋病是由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea(Moug:Fr)CesDe Not)引起的真菌病害,能夠造成梨樹枝條枯死、枝干粗皮和潰瘍,果實腐爛。輪紋病在我國南北梨產(chǎn)區(qū)的危害呈逐年加重趨勢。弱毒相關(guān)病毒導致植物病原真菌致病力衰退,可作為梨輪紋病生物防治的另一條重要途徑。本研究對前期保存的復合感染產(chǎn)黃青霉病毒Botryosphaeria dothidea chrysovirus1 (BdCV1)和雙分體病毒 Botryosphaeria dothidea partitivirus 1 (BdPV1)病毒的 LW-1菌株進行分離,旨在獲得僅感染BdCV1菌株(命名為LW-C),評價該病毒對梨輪紋病菌分離株的影響;檢測并分析來源于湖北省梨輪紋病菌分離株攜帶dsRNA病毒的多樣性,挖掘防治梨輪紋病害的生防資源。以復合感染BdPV1和BdCV1的梨輪紋菌株LW-1、單獨感染BdCV1的LW-C、單獨感染BdPV1的LW-P以及無病毒感染的Mock菌株作為四組材料,構(gòu)建了 4個文庫(分別命名為LW-CP,LW-C,LW-P和Mock),進行de novo測序和小RNA測序,獲得梨輪紋病菌unigene序列信息,分析病毒感染條件下梨輪紋病菌差異表達基因;結(jié)合采用小RNA高通量測序技術(shù),以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫作為miRNA靶基因預測的數(shù)據(jù)庫,對mRNA/miRNA進行了聯(lián)合分析,研究結(jié)果旨在獲得與真菌病毒互作和與梨輪紋病菌致病相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號轉(zhuǎn)導途徑,挖掘防治梨輪紋病菌潛在的基因資源,為梨輪紋病害防治提供新途徑。取得的具體研究結(jié)果如下::1.對與LW-1菌株來源于同一采集地'湖北省武漢市果樹茶葉研究所砂梨種質(zhì)資源圃'的梨樹輪紋病害樣品進行采集,經(jīng)分離、純化,菌落形態(tài)觀察,分子鑒定及其致病力測定,結(jié)果表明,來源于湖北省的6個分離株均為強致病力梨輪紋病菌株B.dothdiea,經(jīng)dsRNA檢測,6個分離菌株均攜帶分子量為1-7kb之間多條dsRNA條帶,存在病毒多樣性;研究結(jié)果為探究真菌病毒防治梨輪紋病害提供生防資源以及真菌病毒分類和進化研究提供材料。2.通過單菌絲分離從LW-1菌株中獲得僅感染BdCV1的梨輪紋病菌菌株(命名為LW-C),證實了 LW-C具有弱毒特性;水平轉(zhuǎn)染結(jié)果明確了 BdCV1因子對梨輪紋菌菌落形態(tài)、生長速度有抑制作用,對梨輪紋病菌寄主有弱致病力。首次證實了產(chǎn)黃青霉病毒科BdCV1成員是引起梨輪紋菌株致病力衰退的主要因子,為真菌病毒防治果樹輪紋病害提供了新穎的生防材料。3.采用 RT-qPCR 分析了 BdCV1 和 BdPV1 的 cp、RdRp基因在 LW-1、LW-C和LW-P菌株培養(yǎng)5 d、10 d、15d的相對表達量,結(jié)果顯示BdCV1和BdPV1的cp、RdRp基因分別在各自單獨感染和復合感染的梨輪紋病菌中表達量是有差異的,揭示了病毒間互作對其表達量有影響。4.構(gòu)建了真菌病毒感染條件下梨輪紋病菌4個文庫,對其進行了 De novo測序,共獲得30,058個Unigene,平均長度為2,128bp,在7大基因數(shù)據(jù)庫進行了注釋,明確了功能分類。獲得了 LW-CP/Mock上調(diào)表達基因5605個,下調(diào)基因3301個;LW-C/Mock上調(diào)表達基因4478個,下調(diào)基因4311個;LW-P/Mock上調(diào)表達基因2596個,下調(diào)基因2328個;以上結(jié)果表明,受BdCV1感染的差異表達基因數(shù)量最多,推測BdCV1對梨輪紋病菌寄主基因表達影響明顯。采用RT-qPCR對病毒感染條件下候選的9個差異基因表達量進行分析,檢測結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序得到的表達趨勢一致,驗證了 RNA-seq測序結(jié)果的可靠性,明確了這些差異基因在病毒感染條件下的表達模式。另外,在梨輪紋病菌中檢測到參與基因沉默途徑的幾個關(guān)鍵基因(Ago、Dicer和RdRp)且在病毒感染條件下均為上調(diào)表達。對病毒感染條件下3組對比文庫的差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG通路分析,結(jié)果顯示,這些基因主要在代謝途徑以及生物合成二級代謝途徑中顯著富集,參與細胞復制、信號轉(zhuǎn)導等抗病途徑。5.小RNA高通量測序發(fā)掘真菌病毒感染響應(yīng)梨輪紋病菌miRNAs的分析:miRNA長度大小以21和22nt為主,LW-CP、LW-C、LW-P和Mock文庫中分別鑒定出63個、48個、83個和86個miRNAs。病毒感染條件下,3組對比文庫 LW-CP/Mock, LW-C/Mock 和 LW-P/Mock 共有 110 個,120 個和88個差異表達的已知miRNAs。韋恩圖結(jié)果顯示,病毒感染條件下的3個對比文庫中公有57個已知miRNA差異表達。另外,LW-CP、LW-C、LW-P和Mock文庫中分別鑒定出25個,37個,20個和19個新的miRNA;新的miRNA在梨輪紋病菌文庫中表達量較低。病毒感染條件下,LW-CP/Mock,LW-C/Mock和LW-P/Mock共有19個,15個和14個新的miRNAs差異表達;韋恩圖結(jié)果顯示,病毒感染條件下的3個對比文庫中公有11個新的miRNA差異表達;新的miRNA成熟序列5'末端第一個堿基主要為U。6.病毒感染條件下梨輪紋病菌miRNA/mRNA負調(diào)控的聯(lián)合分析結(jié)果顯示,GO功能分析主要分為細胞組分、生物過程和分子功能共3種組群,涉及到代謝、細胞、催化反應(yīng)、結(jié)合、轉(zhuǎn)運等組分。KEGG功能分析的結(jié)果顯示,這些差異表達miRNA負調(diào)控的靶基因主要涉及代謝,RNA降解、信號途徑、ABC轉(zhuǎn)運等途徑,表明梨病毒感染條件下miRNA參與了梨輪紋病菌與真菌病毒互作。
【圖文】：

２．４．１．１來源于湖北省的梨輪紋病菌分離株的生物學培養(yǎng)特性逡逑２０１５年７月在‘湖北省武漢市果樹茶葉研宄所砂梨種質(zhì)資源圃’觀察到梨樹枝干逡逑上癥狀呈橢圓形輪紋狀病斑，病斑邊緣翹起，中間呈瘤狀凸起（圖１邋Ａ）。隨機對逡逑其癥狀表現(xiàn)為梨輪紋病害的枝干經(jīng)過分離、純化的的１３個菌株中隨機挑選出６個菌逡逑株，編號命名為邋ＨＢＷＨ－１，ＨＢＷＨ－３，邋ＨＢＷＨ－９，邋ＨＢＷＨ－１０，邋ＨＢＷＨ－１１邋和邋ＨＢＷＨ－１２，逡逑將其分別接種至新鮮的ＰＤＡ平板上，于２５°Ｃ黑暗培養(yǎng)觀察分離菌落形態(tài)并對其生逡逑長速度進行測定。分離株在ＰＤＡ平板上菌絲初期為白色，后期變?yōu)榛揖G色，菌絲氣逡逑生性強（圖邋１Ｂ），ＨＢＷＨ－３，邋ＨＢＷＨ－１０，邋ＨＢＷＨ－１１，邋ＨＢＷＨ－１，邋ＨＢＷＨ－９，邋ＨＢＷＨ－１２逡逑分離株的平均生長速率分別為９．８，１３．５，１３．７，１５．５，１６．１和１６．６邋ｍｍ／ｄ，３－４ｄ長滿逡逑整平板，相比其他分離株，ＨＢＷＨ－３生長稍慢（圖１邋Ｃ）。逡逑＿＿逡逑ＬＪ：Ｘ邋ＸＸＸＪ逡逑ＨＢＷＨ－１邐ＨＢＷＨ－３邐ＨＢＷＨ－９邐ＨＢＷＨ－１０邐ＨＢＷＨ－１１邐ＨＢＷＨ－１２逡逑圖１邋Ａ來源于湖北省菌株梨輪紋病害癥狀（Ａ）；分離純化菌株２５Ｃ，邋３ｄ在ＰＤＡ平板上逡逑的菌落形態(tài)（Ｂ）和生長速率測定（Ｃ）。逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋ｒｉｎｇ邋ｓｐｏｔ邋ｄｉｓｅａｓｅ邋ｏｎ邋ｐｅａｒ邋ｓｔｅｍ邋（Ａ）

需進一步隨機克隆驗證；ｄｓＲＮＡ檢測結(jié)果表明，，來源于湖北省的梨輪紋病菌分離株逡逑攜帶真菌病毒存在多樣性，隨機選取的７個分離菌株帶毒率為１００％，下一步需對該逡逑采樣地的更多梨輪紋病菌分離株攜帶真菌病毒率及其種類進行調(diào)查（圖４）。逡逑Ｍｌ邋２３邐４５６７８邐９逡逑Ｈ邋Ｏ邋Ｌｉ．邋ｌＡＬ邋ｉＪ逡逑圖４梨輪紋病菌分離株攜帶ｄｓＲＮＡ檢測的１．２％瓊脂糖凝膠電泳圖逡逑河為河虹１＜＾１１１（天根公司）；１為陽性對照１＾￥－１，２－８分別為１？＼￥１１－７，１＾＼￥１１－３，：＾胃－９，逡逑ＨＢＷＨ－１０，ＨＢＷＨ－１１，ＨＢＷＨ－１２邋和邋ＨＢＷＨ－１；邋９邋為陰性對照邋ＬＷ－３。，逡逑Ｆｉｇ．邋４邋Ｔｈｅ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｓＲＮＡ邋ｐａｔｔｅｒｎｓ邋ｂｙ邋１．２％邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｂ．邋ｄｏｔｈｄｉｅａ逡逑ｓｔｒａｉｎｓ邋ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋Ｈｕｂｅｉ邋Ｐｒｏｃｉｎｃｅ邋ｏｆ邋Ｃｈｉｎａ．逡逑Ｍ，邋ＤＮＡＭａｒｋｅｒ邋ＩＩＩ（Ｔｉａｎｇｅｎ）；邋１－９，ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＬＷ－１，邋ＨＢＷＨ－７，邋ＨＢＷＨ－３，邋ＨＢＷＨ－９，邋ＨＢＷＨ－１０，逡逑ＨＢＷＨ－１１，邋ＨＢＷＨ－１２，邋ａｎｄ邋ＨＢＷＨ－１邋ａｎｄ邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＬＷ－３，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．逡逑２．４．２邋ＬＷ－ｌ，ＬＷ－Ｃ和ＬＷ－Ｐ菌株垂直傳播分生孢子的ｄｓＲＮＡ檢測逡逑為了明確攜帶病毒的梨輪紋病菌分離株垂直傳播分生孢子攜帶病毒情況，我們逡逑對保存的菌株ＬＷ－１，邋ＬＷ－Ｃ和ＬＷ－Ｐ進行誘導產(chǎn)孢。ＬＷ－１，ＬＷ－Ｃ和ＬＷ－Ｐ菌絲經(jīng)逡逑３０邋ｄ誘導
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S436.612.1

【參考文獻】

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3 孫鑫W

本文編號：2630400