【摘要】：近幾年,隨著甜瓜生產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展,甜瓜雜交品種已被廣泛的應(yīng)用于生產(chǎn)。然而,在人工種子生產(chǎn)過程中,如果隔離不嚴(yán)或者去雄不及時(shí)、不完全等,則易于形成自交種或者有其他假冒偽劣種子的混雜,導(dǎo)致雜種純度降低,使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)遭受嚴(yán)重的損失。為防止這種情況的發(fā)生,甜瓜雜種種子在包裝銷售前必須進(jìn)行快速的純度鑒定。因此,研究薄皮甜瓜雜種純度快速鑒定的方法以及優(yōu)化和建立標(biāo)準(zhǔn)化流程體系十分重要,使其能更廣泛的應(yīng)用于薄皮甜瓜種子市場監(jiān)測和品種的快速鑒定,為實(shí)際生產(chǎn)提供有效的參考。本研究使用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對薄皮甜瓜雜種品種進(jìn)行種子純度的鑒定并建立了SSR標(biāo)記技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化體系,試驗(yàn)研究如下:1.本試驗(yàn)以不同雜交種及其親本共31種薄皮甜瓜品種為試驗(yàn)材料,從數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)中選擇70對引物,通過對雜交種親本進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增分析以及產(chǎn)物的檢測,篩選出了11對多態(tài)性豐富且穩(wěn)定性較好的核心引物。運(yùn)用篩選得到的11對SSR多態(tài)性引物對甜瓜同母異父、同父異母雜交組合進(jìn)行SSR分析,結(jié)果顯示,至少需要兩種或兩種以上的引物才能鑒別雜交種及其同母異父、同父異母雜交組合。研究表明,SSR引物組合法可用于鑒定薄皮甜瓜雜交種的純度,該方法能夠有效的檢測出雜交種中混有的自交系種子,并分辨出同母異父、同父異母雜交種,提高了雜種純度鑒定的準(zhǔn)確度。2.本研究試驗(yàn)材料為兩葉一心時(shí)的甜瓜真葉葉片,分別采用CTAB法和試劑盒法提取DNA并進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果顯示,兩種DNA提取方法都相對較穩(wěn)定、清晰,雜帶較少,均適用于SSR標(biāo)記分析。但試劑盒法的擴(kuò)增條帶比CTAB法的擴(kuò)增條帶更為清晰,效果更加良好。分析并優(yōu)化了影響SSR標(biāo)記穩(wěn)定性的幾個(gè)因素,如模板DNA含量、退火時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、退火溫度、引物濃度等,確定了一套省時(shí)省力、經(jīng)濟(jì)有效的擴(kuò)增程序,最終建立了一個(gè)具有良好的重復(fù)性、高清晰度、高分辨率的薄皮甜瓜標(biāo)準(zhǔn)化SSR-PCR擴(kuò)增體系。反應(yīng)體系:總體積為10μL,包括2μL體積模板DNA,濃度為100-200ng/μL,正反向引物各0.5μL-1μL,3μLmix(Taq DNA聚合酶、buffer和DNTP混合物)和3μL-4μL滅菌水。反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃,5min;95℃變性30s,退火55℃-58℃,40s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃終延伸5min;20μL反應(yīng)體系。3.本研究通過運(yùn)用商品品種設(shè)計(jì)不同純度梯度雜種池進(jìn)行雜種純度鑒定,來替代田間形態(tài)學(xué)純度鑒定驗(yàn)證分子標(biāo)記檢測純度的可靠性。結(jié)果顯示,該方法不僅能縮短純度鑒定驗(yàn)證的時(shí)間和節(jié)省成本,而且也較為準(zhǔn)確的顯示可以用來進(jìn)行SSR分子標(biāo)記可靠性的驗(yàn)證。結(jié)果表明,不同純度雜種池法可以用來代替田間形態(tài)學(xué)鑒定雜種純度驗(yàn)證SSR分子標(biāo)記的可靠性,SSR分子標(biāo)記純度鑒定技術(shù)可用于快速鑒定薄皮甜瓜雜種的純度和真實(shí)性。本試驗(yàn)通過對建立的薄皮甜瓜雜種純度鑒定的SSR分子標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)化體系的反復(fù)驗(yàn)證。結(jié)果顯示,該體系擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復(fù)性好、成本低,適合用于商業(yè)化的薄皮甜瓜雜種純度的鑒定。綜上所述,SSR引物組合法可以有效的提高雜種純度鑒定的準(zhǔn)確性。合適的DNA提取方法,合理的模板DNA含量、退火時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、退火溫度、引物濃度可以提高SSR標(biāo)記擴(kuò)增效果,提高清晰度和亮度,縮短時(shí)間。不同純度雜種池法可以代替田間形態(tài)學(xué)雜種純度鑒定法驗(yàn)證SSR標(biāo)記的可靠性,SSR分子標(biāo)記可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的田間形態(tài)學(xué)雜種純度鑒定方法。本研究優(yōu)化并建立了一套經(jīng)濟(jì)、可靠、實(shí)用的SSR分子標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)化鑒定體系,用于薄皮甜瓜雜交種純度的快速鑒定。
【圖文】：

圖 1 引物 GCM548、SSR12083、CMBR097 擴(kuò)增 14 個(gè)親本的條帶圖譜注：親本：400，401，402，，403，404，406，407，408，412，413，419，420，425，R11Fig.1 Amplification of 14 parental bands by partial primers GCM548、SSR12083、CMBR097Note: Parents:400,401,402,403,404,406,407,408,412,413,419,420,425,R11

408 402 408×402 419 401 419×401 407 400 407×400 R11 400 R11×400圖 2 引物 CMGAN21、CMATN89、CM26、TJ10 對部分甜瓜雜交種擴(kuò)增的條帶圖譜注：樣本：雜交組合分別為 408×402,419×401,407×400,R11×400Fig.2 Amplified band maps of partial melon hybrids with primers CMGAN21, CMATN89, CM26, andTJ10Note: Samples: Hybrid liness were 408×402,419×401,407×400andR11×400, respectively.
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S652

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2613634