【摘要】：柑橘(Citrus)為蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Subfamily aurantioideae)的多年生植物,具有較高的食用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值,是我國(guó)南方最重要的果樹(shù)之一。針對(duì)植物葉片黃化的研究,大多集中在去黃化過(guò)程中不同代謝途徑的調(diào)節(jié)、基因的差異表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯和遺傳改良等方面,這些研究發(fā)現(xiàn)、提供了大量有關(guān)去黃化或轉(zhuǎn)綠的基因和蛋白,有關(guān)于柑橘實(shí)生幼苗葉片黃化轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究鮮有報(bào)道,并未進(jìn)行黃化過(guò)程中葉綠體發(fā)育及光合作用代謝途徑相關(guān)基因的研究。因此,了解幼苗黃化對(duì)光合參數(shù)的影響,并對(duì)不同黃化程度柑橘實(shí)生幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,探究柑橘實(shí)生幼苗黃化過(guò)程中葉綠體發(fā)育及光合作用代謝途徑相關(guān)基因的差異表達(dá),了解XET基因?qū)S化幼苗生長(zhǎng)的調(diào)控作用,對(duì)促進(jìn)柑橘實(shí)生幼苗的正常生長(zhǎng)、產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展都具有重大意義。1.以黃果柑、不知火幼苗為材料,分析黃化苗、花葉苗和綠葉苗的生長(zhǎng)量、葉綠素含量、光合參數(shù)及葉綠素?zé)晒馓匦缘淖兓�。結(jié)果表明,葉片黃化抑制了幼苗的正常生長(zhǎng),黃化苗的生長(zhǎng)量顯著低于綠葉苗;黃化苗葉片中游離脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量均顯著增加;葉片黃化顯著降低了葉片葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、類(lèi)胡蘿卜素(Car)含量和光合作用氣體交換參數(shù)(凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO_2濃度、蒸騰速率),改變了葉綠素的組成比例。黃化苗的F_v/F_m、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)顯著低于綠葉苗,導(dǎo)致凈光合速率(P_n)顯著降低,但花葉苗F_v/F_m下降程度較小。2.利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),研究了不知火、黃果柑黃化幼苗葉片相關(guān)基因的差異表達(dá),獲得了8.34億clean reads和125.12Gb的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),超過(guò)91.37%的reads達(dá)到Q30。12.4952萬(wàn)個(gè)unigenes的平均長(zhǎng)度為1,189bp,分別有79.15%、84.35%、33.62%、63.12%、57.67%、57.99%和37.06%unigenes被注釋到了NR、NT、KO、SwissProt、PFAM、GO和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中。在不知火花葉苗和黃化苗中,鑒定了604個(gè)共同的差異表達(dá)基因,其中180個(gè)上調(diào)基因,424個(gè)下調(diào)基因;而黃果柑花葉苗和黃化苗中有1035個(gè)共同的差異表達(dá)基因,其中271個(gè)為上調(diào)基因,764個(gè)下調(diào)基因;兩個(gè)柑橘品種的不同黃化程度幼苗中均未發(fā)現(xiàn)去黃化過(guò)程(GO:0009704);兩個(gè)雜柑品種的花葉苗和黃化苗中有7個(gè)共同的上調(diào)基因、59個(gè)共同的下調(diào)基因,表明這些基因可能在雜柑幼苗黃化過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用。3.為探究葉綠素合成途徑與黃化的關(guān)系,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),對(duì)不知火、黃果柑的花葉苗和綠葉苗中與光合作用、葉綠素生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)、功能進(jìn)行了分析。獲得了5.67億clean reads和85.05Gb的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),超過(guò)94.19%的reads達(dá)到Q30。同時(shí),在不知火、黃果柑的花葉苗和綠葉苗中分別篩選出了4786和7007個(gè)差異表達(dá)基因。在這些差異調(diào)控通路中,有30個(gè)共同的代謝通路,包括有關(guān)光合作用(GO:0015979)和葉綠體代謝(GO:0009507)的途徑。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),與綠葉苗相比,不知火、黃果柑花葉苗的光合作用通路(KO 00195)中分別有44和63個(gè)差異表達(dá)基因,光合天線蛋白通路(KO 00195)中分別有14和29個(gè)差異表達(dá)基因,而黃酮類(lèi)化合物的生物合成通路(KO 00941)中分別有16和29個(gè)差異表達(dá)基因。PsbQ、PetF、PetB、PsaA、PsaN、PsbP、PsaF和CitXET具有不同的表達(dá)模式,這可能與柑橘實(shí)生幼苗黃化有關(guān)。4.木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(Xyloglucan endotransglycosylase,XET)在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中具有非常重要的作用,為了探究XETs是否參與柑橘實(shí)生幼苗黃化過(guò)程中根、莖的伸長(zhǎng)調(diào)控,本研究對(duì)黃果柑黃化苗CitXET基因的表達(dá)、XET酶活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,種子發(fā)芽15 d后,在黃化苗和花葉苗莖中CitXET基因是顯著下調(diào)表達(dá)的,但在根冠頂端是顯著上調(diào)表達(dá)的。通過(guò)NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI Conserved Domains Database,NCBI-CDD)、InterPro和ScanProsite分析表明,CitXET是糖基水解酶16家族(GH16)的成員,包括-DEIDFEFLG-特征序列。不同黃化程度柑橘實(shí)生幼苗的CitXET基因表達(dá)模式和XET酶活性有較大的差異,XET酶活性以及CitXET基因表達(dá)量的改變可能參與了幼苗黃化過(guò)程中根、莖的生長(zhǎng)和發(fā)育。5.通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育和分層聚類(lèi)分析等方法分析了20個(gè)XET基因的4500個(gè)密碼子使用偏性。結(jié)果表明20個(gè)XET基因分成兩個(gè)組,這些基因中使用最多的四個(gè)密碼子分別是AGA、AGG、AUC和GUG。另外,得到CitXET基因的8個(gè)最優(yōu)密碼子,即是AGA、AUU、UCU、CUU、CCA、GCU、GUU和AAA。堿基組成對(duì)密碼子偏好性有較強(qiáng)的影響,這可能與XET基因功能有關(guān)。影響密碼子使用偏性的主要因素(軸1和2)分別為54.8%和17.6%。PgXET、ZmXET、VlXET、VrXET和PcXET基因中GC含量相對(duì)較高,而CitXET、DpXET和BrpXET基因中GC含量相對(duì)較低。盡管XET基因也有一些密碼子使用偏性,但不同XET基因通常表現(xiàn)出不同的密碼子使用模式。XET基因的遺傳距離越近,其密碼子使用偏好性越相似。
【圖文】：

苗放入人工氣候箱中（光照800 μmol·m-2 s-1，光周期為12:12 h，光照時(shí)溫度為25 1℃夜間溫度為 20 1℃，空氣相對(duì)濕度為 50-60%）培養(yǎng)。于萌芽后 20 d，選取不知火和黃果柑黃化苗、花葉苗和綠葉苗為試驗(yàn)材料，，進(jìn)行幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)及光合作用參數(shù)的測(cè)定，試驗(yàn)樣品詳見(jiàn)圖 2-1。

圖 3-1 不知火、黃果柑 Unigenes 在 NCBI NR 數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種分類(lèi)和 e-value 值分布情況Fig. 3-1 Species classification (A) and e-value distribution (B) of the unigenes of Shiranuhi aHuangguoganannotated to NCBI NR database.3.2.2 基因表達(dá)水平的評(píng)價(jià)
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S666

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本文編號(hào)：2611957