【摘要】：占我國(guó)蘋果栽培面積70%的‘富士’品種成花難、大小年結(jié)果現(xiàn)象普遍發(fā)生,是產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的關(guān)鍵瓶頸問題之一。GA具有抑制蘋果等木本植物成花的效應(yīng),蘋果花芽孕育及大小年形成與幼果種子中合成的GA調(diào)控密切相關(guān),相關(guān)調(diào)控機(jī)制有待深入解析。本研究通過對(duì)蘋果赤霉素合成通路中的氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox進(jìn)行全基因組鑒定與分析,測(cè)定其表達(dá)模式,篩選參與花芽孕育調(diào)控的候選基因,并進(jìn)行克隆與分析;同時(shí)對(duì)GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的MdGAMYB基因的表達(dá)模式、基因和啟動(dòng)子克隆序列、外源轉(zhuǎn)化番茄的功能及互作蛋白進(jìn)行研究分析。主要結(jié)果如下:1、蘋果赤霉素氧化酶家族成員鑒定、進(jìn)化、表達(dá)特性及候選成員的克隆。(1)從蘋果基因組里鑒定出41個(gè)赤霉素氧化酶基因,其中GA2ox類20個(gè),GA3ox類14個(gè),GA20ox類7個(gè);蘋果表達(dá)量數(shù)據(jù)庫(kù)組織特異性分析發(fā)現(xiàn)其在不同品種不同組織部位差異表達(dá),其中花和果實(shí)中高表達(dá)。(2)結(jié)合生物信息學(xué)和‘長(zhǎng)富2號(hào)’花芽孕育過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果,挑選出8個(gè)表達(dá)較高的基因MdGA2ox4/6/9/12,MdGA3ox5/12和MdGA20ox1/5。GA_3處理后,花芽孕育不同時(shí)期GA20ox類氧化酶基因表達(dá)均下調(diào),GA2ox類氧化酶基因表達(dá)均上調(diào),GA3ox類氧化酶基因表達(dá)模式不一致,基本符合負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。PAC處理后,這3類基因表達(dá)整體下調(diào),大部分基因表達(dá)不符合負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。(3)克隆了‘長(zhǎng)富2號(hào)’和‘煙富6號(hào)’的MdGA2ox9、MdGA3ox12和MdGA20ox5基因,序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),2個(gè)品種中MdGA2ox9和MdGA20ox5的堿基序列完全一致,而MdGA3ox12基因在‘煙富6號(hào)’中克隆得到兩種序列,存在2個(gè)氨基酸的突變,第66個(gè)氨基酸由纈氨酸(V)突變?yōu)榱涟彼?L),第137個(gè)氨基酸由精氨酸(R)突變?yōu)楦拾彼?G),且突變發(fā)生在的保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域。(4)對(duì)3個(gè)基因MdGA2ox9、MdGA3ox12和MdGA20ox5表達(dá)分析顯示,這3個(gè)基因在不同組織中均有表達(dá),MdGA2ox9和MdGA20ox5在花和芽中表達(dá)都相對(duì)較高;在難成花的‘長(zhǎng)富2號(hào)’中赤霉素合成類的基因MdGA20ox5和MdGA3ox12較易成花‘煙富6號(hào)’表達(dá)更高,相反分解類基因MdGA2ox9則在‘長(zhǎng)富2號(hào)’中表達(dá)較低;不同大小年花芽中,MdGA3ox12和MdGA20ox5在大年芽中均高于小年芽,MdGA2ox9則相反。這些結(jié)果暗示了它們可能參與蘋果的花芽孕育和大小年調(diào)控。2、MdGAMYB基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子序列克隆,表達(dá)特性和功能分析。(1)克隆了蘋果6個(gè)成花特性不同的栽培品種和2個(gè)砧木材料的MdGAMYB的序列,結(jié)果顯示:8份材料中MdGAMYB的基因序列存在差異,蛋白比對(duì)結(jié)果顯示,保守區(qū)域未發(fā)生較大差異�？寺×�3個(gè)成花特性不同的蘋果品種的MdGAMYB啟動(dòng)子序列,結(jié)果顯示‘秦冠’與‘富士’品種(‘煙富6號(hào)’和‘玉華早富’)存在較大片段差異,啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),在不同品種中也出現(xiàn)了激素響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件的差異。(2)表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),MdGAMYB在葉、花和芽中表達(dá)量較高;GA_3處理后,MdGAMYB的表達(dá)受到了顯著抑制,在PAC處理后,則呈現(xiàn)相反趨勢(shì);在難成花的‘長(zhǎng)富2號(hào)’中表達(dá)顯著低于易成花的‘煙富6號(hào)’;在‘長(zhǎng)富2號(hào)’大年、小年花芽中沒有明顯的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明MdGAMYB受GA的負(fù)調(diào)控,可能參與蘋果花芽孕育。(3)在番茄中異源過表達(dá)MdGAMYB。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MdGAMYB轉(zhuǎn)基因陽性番茄株系開花時(shí)間相較于野生型提前,且過表達(dá)陽性株系中與番茄花芽孕育相關(guān)基因的表達(dá)也受到顯著的影響。為探討MdGAMYB調(diào)控單性結(jié)實(shí)的功能,對(duì)蘋果進(jìn)行單性結(jié)實(shí)處理,結(jié)果表明在GA_(4+7)處理后15 d內(nèi),MdGAMYB的表達(dá)量顯著低于授粉對(duì)照。處理后120 d的幼果中MdGAMYB的表達(dá)量顯著高于授粉對(duì)照。3、MdGAMYB的酵母雙雜交篩庫(kù)獲得39個(gè)陽性結(jié)果,經(jīng)過序列比對(duì)和功能預(yù)測(cè),獲得3個(gè)激素相關(guān)的基因,3個(gè)在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要功能的基因和9個(gè)功能酶蛋白。
【圖文】：

已經(jīng)總結(jié)出了調(diào)控植物開花的6條途徑，包括：春化、自主、年齡、光周期、溫敏、赤霉素途徑（Mouradovet al. 2002）。這6條途徑之間彼此獨(dú)立又互相聯(lián)系，形成了復(fù)雜精密的成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（張藝能 等 2014）（圖1-1 ）。植物經(jīng)過 系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過調(diào)控關(guān)鍵成花基因的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)開花時(shí)間、數(shù)量、質(zhì)量等方面的控制。圖 1-1 擬南芥成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖（張藝能 等 2014）Fig. 1-1 Schematic diagram of Arabidopsis flowering regulation network（張藝能 等 2014）

西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1-2 擬南芥中GA調(diào)控的成花途徑（Mutasa-Gottgens and Hedden 2009）Fig. 1-2 Flowering pathways regulated by GA in Arabidopsis（Mutasa-Gottgens and Hedden 2009）1.2 蘋果花芽分化研究進(jìn)展蘋果花芽分化是形成果實(shí)的基礎(chǔ)，花芽形成的質(zhì)量對(duì)果實(shí)的品質(zhì)、數(shù)量等具有重要的影響，花芽分化過程受內(nèi)在（樹體的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)、激素水平等）和外在（溫度、氣候等環(huán)境因素）等各種因素的影響（李燁 2009）。因此加強(qiáng)對(duì)蘋果花芽分化的研究具有重要的意義。1.2.1 蘋果花芽分化過程蘋果的花芽分化過程比較復(fù)雜，，周期較長(zhǎng)，從春梢停長(zhǎng)前后，到翌年開花前 直在進(jìn)行，主要包括3個(gè)時(shí)期：生理分化期、形態(tài)分化期以及花芽進(jìn) 步發(fā)育期（性細(xì)胞形成期）（潘換來 2018）。其中生理分化期是蘋果花芽形成的關(guān)鍵時(shí)期，在這時(shí)期芽的生長(zhǎng)點(diǎn)發(fā)生了生理上的質(zhì)變，是芽體發(fā)育的重要轉(zhuǎn)折期，決定能否形成花芽，因此又被稱作‘花芽孕育臨界期’（潘換來 2018）。這 關(guān)鍵時(shí)期起始于新梢長(zhǎng)出頂芽或腋花芽后，枝條停止生長(zhǎng)時(shí)，終止于花芽形態(tài)分化期開始之前（曹尚銀 等2001）
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S661.1

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本文編號(hào)：2607704