鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是一種可引起魚類高致死性出血性敗血癥的病原菌,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害和經(jīng)濟(jì)損失,迫切需要建立一種準(zhǔn)確、便捷的鰻弧菌檢測(cè)方法用于疾病的防控。目前文獻(xiàn)已報(bào)道的鰻弧菌檢測(cè)方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作過程復(fù)雜等問題,無法應(yīng)用于養(yǎng)殖漁場(chǎng)等基層單位。本課題基于抗體標(biāo)記技術(shù)開發(fā)以膠體金、量子點(diǎn)及上轉(zhuǎn)磷光材料作為標(biāo)記物的快速免疫層析法檢測(cè)鰻弧菌,為鰻弧菌病害的防控提供便捷的檢測(cè)方法。 本課題以實(shí)驗(yàn)室分離的一株鰻弧菌毒株MVM425滅活菌體為抗原,制備鰻弧菌單克隆抗體5G4-G4和5G4-B8。以膠體金作為標(biāo)記材料對(duì)鰻弧菌單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記,制備出鰻弧菌膠體金快速檢測(cè)試紙條。該試紙條具有良好的特異性,與弧菌屬常見的病原菌無交叉反應(yīng),其檢測(cè)限達(dá)到105CFU/ml。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)磷光材料作為抗體標(biāo)記物,可以大幅度提高檢測(cè)靈敏度,實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物的微量和定量檢測(cè)。本課題考察了核-殼型量子點(diǎn)材料CdSe/ZnS和上轉(zhuǎn)磷光材料NaYF4:Yb, Er作為抗體標(biāo)記物在鰻弧菌檢測(cè)中應(yīng)用的可行性。通過優(yōu)化抗體與這兩種材料的最佳結(jié)合量,獲得量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)磷光材料標(biāo)記...

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 鰻弧菌
    1.2 鰻弧菌的檢測(cè)方法
        1.2.1 基于細(xì)菌培養(yǎng)及生理生化指標(biāo)檢測(cè)的方法
        1.2.2 基于免疫及分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法
    1.3 基于免疫層析技術(shù)的快速檢測(cè)試紙條
        1.3.1 快速檢測(cè)試紙條
        1.3.2 快速檢測(cè)紙條的原理和結(jié)構(gòu)
        1.3.3 快速檢測(cè)試紙條在病原菌檢測(cè)方面的應(yīng)用
    1.4 抗體標(biāo)記物
        1.4.1 納米金顆粒
        1.4.2 量子點(diǎn)
        1.4.3 上轉(zhuǎn)磷光材料
    1.5 本課題的主要內(nèi)容和意義
第2章 鰻弧菌單克隆抗體的制備
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 細(xì)胞、細(xì)菌及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與緩沖液
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 制備滅活菌液
        2.3.2 Sp2/0細(xì)胞的復(fù)蘇
        2.3.3 采集陰性血清
        2.3.4 免疫小鼠
        2.3.5 測(cè)定血清中抗體效價(jià)的方法
        2.3.6 準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞
        2.3.7 細(xì)胞融合
        2.3.8 融合細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.3.9 篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株
        2.3.10 雜交瘤細(xì)胞株的去交叉反應(yīng)
        2.3.11 雜交瘤細(xì)胞株的克隆
        2.3.12 雜交瘤細(xì)胞株的凍存
        2.3.13 單克隆抗體的純化
        2.3.14 抗體的亞型鑒定
        2.3.15 單克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)
        2.3.16 單克隆抗體的濃度測(cè)定
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 小鼠的免疫
        2.4.2 細(xì)胞融合及去交叉反應(yīng)結(jié)果
        2.4.3 雜交瘤細(xì)胞的克隆及去交叉反應(yīng)結(jié)果
        2.4.4 單克隆抗體的亞型測(cè)定
        2.4.5 單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定
        2.4.6 單克隆抗體的濃度測(cè)定
    2.5 討論
    2.6 結(jié)論
第3章 鰻弧菌膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備
    3.1 前言
    3.2 材料
        3.2.1 細(xì)菌及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 多克隆抗體的制備
        3.3.2 多克隆抗體蛋白濃度的測(cè)定
        3.3.3 制備膠體金溶液
        3.3.4 膠體金溶液與抗體的結(jié)合
        3.3.5 膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備
        3.3.6 膠體金快速檢測(cè)試紙條性能檢測(cè)
        3.3.7 與多重PCR檢測(cè)方法的比較
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 多克隆抗體效價(jià)
        3.4.2 膠體金溶液的制備
        3.4.3 膠體金溶液與抗體的結(jié)合
        3.4.4 抗體配對(duì)結(jié)果
        3.4.5 膠體金快速檢測(cè)試紙條的性能測(cè)定
        3.4.6 膠體金快速檢測(cè)試紙條與多重PCR檢測(cè)方法的比較
    3.5 討論
    3.6 結(jié)論
第4章 量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)磷光材料的應(yīng)用探索
    4.1 前言
    4.2 材料
        4.2.1 菌株
        4.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 量子點(diǎn)與抗體的結(jié)合
        4.3.2 量子點(diǎn)與抗體結(jié)合的驗(yàn)證
        4.3.3 量子點(diǎn)與抗體的最佳結(jié)合量
        4.3.4 斑點(diǎn)免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的檢測(cè)性能
        4.3.5 量子點(diǎn)快速檢測(cè)試紙條的研制
        4.3.6 上轉(zhuǎn)磷光材料與抗體的結(jié)合
        4.3.7 上轉(zhuǎn)磷光材料與抗體結(jié)合的驗(yàn)證及最佳結(jié)合量確定
        4.3.8 上轉(zhuǎn)磷光與抗體快速檢測(cè)試紙條的研制
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的驗(yàn)證結(jié)果
        4.4.2 量子點(diǎn)與抗體的最佳結(jié)合量
        4.4.3 斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)考察量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的檢測(cè)性能
        4.4.4 量子點(diǎn)快速檢測(cè)試紙條的研制
        4.4.5 上轉(zhuǎn)磷光材料與抗體結(jié)合的驗(yàn)證及最佳結(jié)合量確定
        4.4.6 上轉(zhuǎn)磷光材料快速檢測(cè)試紙條的研制
    4.5 討論
    4.6 結(jié)論
第5章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3952154