卵黃抑制激素(vitellogenesis-inhibiting hormone,VIH)是甲殼動物高血糖激素家族特有的成員之一,作為一種重要的神經(jīng)肽激素,在調(diào)控甲殼動物卵黃蛋白原的生成過程中起到關鍵的作用。本研究是在課題組已有的部分VIH基因片段的基礎上,通過Genome walker、Tail-PCR和常規(guī)PCR等技術克隆獲得該基因的cDNA全長和基因組DNA序列以及5’調(diào)控區(qū)序列。并結合體外重組表達、細胞培養(yǎng)、瞬時轉染和雙熒光素酶報告基因檢測等方法,在轉錄調(diào)控和翻譯水平揭示VIH的結構特征和本身的轉錄調(diào)控機制。主要研究結果如下:1)采用Genome walker技術克隆出SpVIH基因的cDNA全長634 bp,開放閱讀框(open reading frame,ORF)為375 bp,可編碼125個氨基酸,包括信號肽(1-22aa)和成熟肽兩部分。成熟肽包括CHH家族中6個位置較為保守的半胱氨酸(Cys)殘基,同時在成熟肽第12位有CHH家族II型肽特有的Gly~(12)。同源性比對和系統(tǒng)進化樹分析均表明,SpVIH屬于CHH家族II型肽。空間結構分析表明,其與南美白對蝦(LvVIH)的空間結構高度相似,由5個α螺旋和多個無規(guī)則卷曲組成。2)采用常規(guī)PCR技術首次克隆出SpVIH基因的gDNA全長790 bp,由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成,外顯子和內(nèi)含子均位于ORF內(nèi),內(nèi)含子在SpVIH成熟肽Arg(AGG)和Arg(AGG)的密碼子之間。其內(nèi)含子和外顯子之間并不遵循典型的“GT-AG”或“AT-AC”規(guī)則。3)通過原核表達技術對SpVIH的成熟肽部分進行體外重組表達,在29 kDa和31 kDa左右同時出現(xiàn)兩條蛋白條帶。經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析顯示,上下兩種蛋白測出的肽段序列與已知蛋白序列的覆蓋率分別為57.8%和61.8%,均認為是目的條帶。同時對29 kDa左右的蛋白進行鎳柱純化,并制備多克隆抗體。經(jīng)western blot驗證后,發(fā)現(xiàn)該抗體能特異地和這兩個大小不一的蛋白結合。4)通過Genome walker和Tail-PCR聯(lián)用技術克隆獲得VIH基因的5’上游調(diào)控區(qū)序列,從翻譯起始位點(ATG)起,共3070 bp,從預測的轉錄起始位點(A)起,共2398 bp。CpG島預測軟件分析其不含CpG島。通過生物信息學預測軟件和啟動子活性分析表明,其核心啟動子區(qū)位于-203 bp—+213 bp之間,包含在線軟件預測的轉錄起始位點區(qū)域。在轉錄起始位點(A)上游-28 bp處存在TATA box。將pSpVIH-1(含核心啟動子區(qū))重組至轉基因載體pEGFP-1上,在HEK293FT細胞中能驅動EGFP的表達。5)不同長度缺失片段啟動子活性分析表明,在pSpVIH-4和pSpVIH-6之間可能同時存在正調(diào)控和負調(diào)控的轉錄因子。對該區(qū)域預測的Sox9結合位點進行位點突變和活性分析,發(fā)現(xiàn)突變該位點其活性發(fā)生顯著性降低(p0.05),表明Sox9可能是正調(diào)控擬穴青蟹VIH基因表達的重要轉錄因子。
【學位單位】：集美大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：Q78;S917.4
【部分圖文】：

圖 3.4 SpVIH 的系統(tǒng)進化樹分析所用 CHH 氨基酸序列的物種名和相應的登錄號分別為：擬穴青蟹（Scylla paramamosain）CHH， AFM35652.1； 藍蟹（Callinectes sapidus）CHH2，ACH85179.1；羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii） CHH，AF372657_1；三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）CHH，ACB46189.1；日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）CHH，BAE78493.1；普通濱蟹（Carcinus maenas）CHH，AF286094_1；南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）CHH-B，AAN86057.1；歐洲龍蝦（Homarusgammarus）CHH-B，ABA42180.1；斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）CHH1，AAQ24525.1；美洲海螯蝦（Homarus americanus）CHH-A，AAB32871.1；云斑厚紋蟹（Pachygrapsus marmoratus）CHH，AAM21927.1； 刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）CHH，BAJ23164.1。 所用 VIH/GIH 氨基酸序列信息如圖 3.4 注釋。 擬穴青蟹 SpVIH 用紅色菱形（ ）標注，節(jié)點數(shù)字代表置信度，樹枝長度代表遺傳距離。3.5 SpVIH 空間結構的預測利用 SWISS-MODEL 在線同源建模方法和三維結構模型查看軟件 PyMOL，分別對SpVIH、LvVIH 和 SpCHH 空間三維結構進行模擬。結果顯示 SpVIH 由 5 個α螺旋和多個無規(guī)則卷曲組成（圖 A），與 LvVIH 的空間結構（圖 B）極其相似。去除 SpVIH 成熟肽12

圖 3.5 SpVIH、LvVIH 和 SpCHH 空間三維結構的模擬A：SpVIH 的空間三維結構； B：LvVIH 的空間三維結構；C：去除成熟肽 Gly12 后 SpVIH 的空間三維結構；D：SpCHH1 的空間三維結構。3.6 原核表達3.6.1 含酶切位點目的片段的獲得以擬穴青蟹眼柄逆轉錄后的cDNA第一條鏈為模板，根據(jù)SpVIH基因的ORF（去除信號肽后對應的核苷酸序列）序列分別設計含有酶切位點BamH I的上游引物和Xho I的下游引物，進行PCR擴增獲得300 bp左右的基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖3.6）。將目的條帶進行割膠回收并測序后，最終得到324 bp的基因序列（包括酶切位點和保護堿基序列），且與已知序列完全一致。

肽后對應的核苷酸序列）序列分別設計含有酶切位點BamH I的上游引物和Xho I的下游引物，進行PCR擴增獲得300 bp左右的基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖3.6）。將目的條帶進行割膠回收并測序后，最終得到324 bp的基因序列（包括酶切位點和保護堿基序列），且與已知序列完全一致。
【參考文獻】

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本文編號：2845933