發(fā)布時(shí)間：2020-09-29 15:46

　　 貝類是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物,可創(chuàng)造出巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而,近年來(lái)病害的頻繁侵襲使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,為了預(yù)防和控制貝類水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生,深入研究其免疫防御機(jī)制是很有必要的,尤其是對(duì)病原識(shí)別機(jī)制的研究。C-型凝集素和ClqDC蛋白是重要的病原識(shí)別分子,但目前對(duì)于其功能的研究還很少。為了闡明他們?cè)诘种撇≡肭诌^(guò)程中的作用,以及他們是否具有特異性,我們用軟體動(dòng)物對(duì)其相關(guān)功能做了一些研究。本研究選取三角帆蚌作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,研究C-型凝集素和含Clq結(jié)構(gòu)域蛋白在其免疫防御中的作用。1、三角帆蚌C-型凝集素(HcLec4)作為模式識(shí)別受體參與抗細(xì)菌免疫反應(yīng)在無(wú)脊椎動(dòng)物中已有報(bào)道,許多C-型凝集素(CTL)參與了先天免疫反應(yīng),如多酚氧化酶的激活,細(xì)胞的黏附,細(xì)菌清除和吞噬作用,以往的研究主要集中在C-型凝集素糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRDs)功能方面。目前,對(duì)三角帆蚌C-型凝集素CRD結(jié)構(gòu)域功能方面的研究還很少。本研究以三角帆蚌作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,從三角帆蚌克隆得到一個(gè)含有四個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域的凝集素基因,命名為HcLec4,該基因四個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域被分別命名為CRD1、CRD2、CRD3和CRD4,并對(duì)該HcLec4基因在先天免疫中的功能進(jìn)行了初步的研究。運(yùn)用RACE技術(shù)得到該基因cDNA序列的全長(zhǎng),為2218bp,擁有一個(gè)1860bp的開(kāi)放閱讀框,編碼620個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,該基因的四個(gè)CRD蛋白彼此之間有所不同。在mRNA水平上,HcLec4廣泛分布于三角帆蚌被檢測(cè)的組織中,包括血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、外套膜和斧足,并在肝胰腺中具有相對(duì)較高的表達(dá)水平。HcLec4基因在肝胰腺組織中,受金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和副溶血弧菌感染后,其在感染初期(2h)表達(dá)量顯著下調(diào)。我們進(jìn)一步分析了HcLec 基因四個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域的細(xì)菌結(jié)合和糖結(jié)合活性,結(jié)果顯示,四個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域能與多種細(xì)菌、脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)結(jié)合。沉默HcLec4基因后,其細(xì)菌清除能力提高,抗菌肽(AMPS)表達(dá)水平上調(diào)。綜上所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HcLec4基因可能在細(xì)菌感染早期通過(guò)調(diào)節(jié)抗菌肽的表達(dá)發(fā)揮抗菌作用。2、三角帆蚌HcClqDC基因作為模式識(shí)別受體參與抗細(xì)菌免疫應(yīng)答反應(yīng)Clq是補(bǔ)體C1復(fù)合物的關(guān)鍵部件,這部分包含有一個(gè)球狀Clq (gClq)結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域具有顯著的配體結(jié)合特性。Clq結(jié)構(gòu)域包含蛋白(ClqDC)由一個(gè)gClq域組成,在無(wú)脊椎動(dòng)物中存在許多能夠識(shí)別非自我配體的ClqDC蛋白。本研究我們從三角帆蚌中鑒定出四個(gè)HcClqDC基因,即HcClqDCl-HcClqDC4。HcClqDC1-HcClqDC4 分別編碼 224、204、305 和 332 個(gè)氨基酸。HcClqDCl-HcClqDC3基因序列的C末端含有一個(gè)gClq域,HcClqDC4基因序列中除了有一個(gè)gClq域之外,還有一個(gè)卷曲螺旋區(qū)。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,四個(gè)HcClqDC基因與來(lái)自軟體動(dòng)物的ClqDC基因具有高度的同源性。組織分布結(jié)果顯示,HcClqDCl-HcClqDC4廣泛分布于血細(xì)胞、肝胰臟、鰓、外套和斧足中。表達(dá)模式結(jié)果顯示,四個(gè)HcClqDC基因在細(xì)菌感染后其表達(dá)量變化較明顯。細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,四個(gè)重組的HcClqDC蛋白對(duì)所選取的細(xì)菌都有結(jié)合活性。綜上所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,四個(gè)HcClqDC基因可能作為模式識(shí)別受體參與了抗細(xì)菌免疫應(yīng)答作用。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S944.2
【部分圖文】：

效的病害防治方式提供新的思路和理論指導(dǎo)。逡逑１．６．３技術(shù)路線逡逑采用以下技術(shù)路線對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)的研[�，壤_跡保插義希暄鏡氖占義希駑危�，逦＾逦ｖ埼ｋ讬┋分布辶x先欠齦咄坎廡蟈義匣蠔停茫歟瘢模緬澹煎澹芻竦茫牛櫻孕潁叔危ā危掊邋五義系鞍椎墓δ苧繡沖危恚遙危了藉澹掊灞澩錟Ｊ藉義希鄭叔危坼騫δ苧繡沖危卞邋五邋五義希蓿掊蝸婦宄義希危危簀危掊澹櫻椋遙危鈴邇佩澹у義希掊澹遙粒茫偶際躉窕澹叔五五五義弦蛉ば蛄繡澹苠危煽咕募觳忮義希體危叔五五邋五義現(xiàn)刈楸澩镥義�，逦＾邋ｑw逶靨騫菇ㄥ義希ǖ鞍姿劍卞五五義希齬δ軃w邐「卜糖結(jié)合）逡逑４邋ｓａｍ邋）邋＾逡逑１｜細(xì)菌結(jié)合逡逑圖１．２／／ｃＬｍ／

逑作為內(nèi)參基因，我們選取了五種組織進(jìn)行了研宄，包括血細(xì)胞、肝胰腺、逡逑鰓、外套膜和斧足，結(jié)果表明Ｚ／ｃＺｅｄ在被檢測(cè)的五種組織中均有分布（圖２．４Ａ），逡逑其中，在肝胰腺組織中表達(dá)量最高。逡逑此外，使用實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ方法檢測(cè)了邋Ｚ／ｃＺｅｃ＃在ＰＢＳ、大腸桿菌、副逡逑溶血弧菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌刺激后在肝胰腺組織中的表達(dá)模式。逡逑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在ＰＢＳ刺激后／／ｅｌｅｃ＃表達(dá)水平無(wú)明顯變化（圖２．４Ｂ），作為實(shí)逡逑驗(yàn)對(duì)照組，Ｚ／ｃＺｅｃ彳在大腸桿菌感染后２邋ｈ和１２邋ｈ表達(dá)量顯著下調(diào)（圖２．４Ｃ），／／ｃＩｅｃ４逡逑在副溶血弧菌感染后２ｈ表達(dá)量顯著下調(diào)，２４ｈ達(dá)到最高水平（圖２．４Ｄ），逡逑在枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌感染后２邋ｈ表達(dá)量顯著下調(diào)，１２邋ｈ達(dá)到最高水逡逑平（圖２．４Ｅ和２．４Ｆ）。因此

ＧＦＰ－ＲＮＡｉ組肝胰腺組織中的表達(dá)情況（圖Ａ）。ＨｃＬｅｄ基因沉默后，向三角帆蚌斧足中注逡逑射入金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌，收集血淋巴并將其培養(yǎng)在ＬＢ平板上，計(jì)算細(xì)菌數(shù)，ＧＦＰ逡逑作為對(duì)照（圖２．７Ｂ和２．７Ｃ）。ｄｓＲＮＡ注射入三角帆蚌斧足內(nèi)，兩天后，再向三角帆蚌斧足逡逑內(nèi)注射入金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌，然后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ檢測(cè)／ｆｏｉｅ以表達(dá)水平逡逑（２．７Ｄ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ邋檢測(cè)抗菌肽因子邋Ｔｈｅ，邋ＴＮＦ，邋ＷＡＰ１邋和邋ＷＡＰ２邋的表達(dá)水平（２．７Ｅ、２．７Ｆ、逡逑２．７Ｇ、２．７Ｈ），星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異的顯著性（Ｐ＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ邋２．７邋（Ａ）邋ＨｃＬｅｃ４邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｍｕｓｓｅｌｓ邋（ｌｅｆｔ邋ｃｏｌｕｍｎ），逡逑／／ｄｅｃ彳－ＲＮＡｉ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｍｉｄｄｌｅ邋ｃｏｌｕｍｎ），邋ａｎｄ邋Ｇ／Ｐ－ＲＮＡｉ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｒｉｇｈｔ邋ｇｒｏｕｐ）邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ．逡逑（２．７Ｂ邋ａｎｄ邋２．７Ｃ）邋Ｍｕｓｓｅｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ａｎｄ邋Ｖ．邋ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ邋ｓ＆ｓｘ邋ＨｃＬｅｃ４邋ｗａｓ逡逑ｋｎｏｃｋｅｄ邋ｄｏｗｎ．邋Ｔｈｅ邋ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ邋ｗａｓ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｏｎ邋ａ邋ＬＢ邋ｐｌａｔｅ邋ｆｏｒ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｃｏｕｎｔ．邋ＧＦＰ逡逑ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋（２．７Ｄ）邋ｄｓＲＮＡ邋ｗａｓ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｍｕｓｓｅｌｓ

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號(hào)：2829935