金錢魚(yú)(Scatophagus argus)是一種廣鹽性海洋物種,能夠耐受大范圍的環(huán)境鹽度,是研究生長(zhǎng)發(fā)育和鹽度應(yīng)激反應(yīng)的理想模型。此外,該品種在中國(guó)廣東省沿海地區(qū)廣泛飼養(yǎng),為當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展提供了可觀的商業(yè)價(jià)值。鹽度是影響魚(yú)類生長(zhǎng)發(fā)育的重要參數(shù),是硬骨魚(yú)在淡水和海水中面臨的挑戰(zhàn)之一。鹽度在一定范圍內(nèi)波動(dòng)會(huì)對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,具體表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)代謝率的變化、滲透調(diào)節(jié)能力的變化。環(huán)境鹽度變化會(huì)對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,影響生物維持體內(nèi)滲透平衡。在環(huán)境鹽度波動(dòng)過(guò)程中,激素在維持硬骨魚(yú)生理平衡和調(diào)節(jié)生長(zhǎng)方面起著至關(guān)重要的作用。大量研究表明硬骨魚(yú)的生長(zhǎng)主要是由GH/IGF-I軸調(diào)控的,其中生長(zhǎng)激素(Growth hormone,GH)發(fā)揮主要的作用。GH/IGF-I軸主要包括生長(zhǎng)激素,生長(zhǎng)激素受體(growth hormone receptor,GHR)以及胰島素樣生長(zhǎng)因子I(insulin-like growth factor I)等關(guān)鍵內(nèi)分泌激素。在魚(yú)類中,GH產(chǎn)生于垂體前葉,通過(guò)與生長(zhǎng)激素受體(growth hormone receptor,GHR)結(jié)合發(fā)揮作用,最終在肝臟中促進(jìn)IGF-I的合成。在硬骨魚(yú)適應(yīng)不同鹽度海水的過(guò)程中,皮質(zhì)醇發(fā)揮著重要的生理作用。皮質(zhì)醇發(fā)揮其生理作用主要是通過(guò)與其受體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的,在硬骨魚(yú)中皮質(zhì)醇受體主要包括糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptors,GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptors,MR)。為了評(píng)估不同環(huán)境鹽度對(duì)金錢魚(yú)生長(zhǎng)作用的影響,我們將金錢魚(yú)在野外3處不同環(huán)境鹽度(2±0.5、25±2.2和35±3.1)下飼養(yǎng)了5個(gè)月(從2015年4月到8月)。本研究中,首先我們通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)克隆了金錢魚(yú)IGF-I和GHR的全長(zhǎng)cDNAs,并通過(guò)半定量檢測(cè)了GH、GHR和IGF-I在金錢魚(yú)不同組織中的表達(dá)模式。通過(guò)RT-PCR技術(shù)測(cè)定了不同鹽度下垂體中GH、肝臟中GHR和IGF-I mRNA的表達(dá)水平變化,通過(guò)ELISA測(cè)量不同鹽度下血清中GH的含量。同時(shí)記錄下金錢魚(yú)不同采樣時(shí)間里各個(gè)鹽度實(shí)驗(yàn)樣本的全長(zhǎng)和體重?cái)?shù)據(jù),計(jì)算出每個(gè)月每組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的平均長(zhǎng)度、平均體重(Body Weight,BW)和特殊生長(zhǎng)生長(zhǎng)率(special growth rate,SGR)。在硬骨魚(yú)受環(huán)境鹽度應(yīng)時(shí),在這個(gè)過(guò)程中體內(nèi)的HPI軸發(fā)揮主要作用。皮質(zhì)醇是HPI軸的重要組成成分,在硬骨魚(yú)中,皮質(zhì)醇可以通過(guò)特定的受體,如糖皮質(zhì)激素受體(GR)和糖皮質(zhì)激素受體(MR),同時(shí)發(fā)揮糖皮質(zhì)激素和礦物質(zhì)皮質(zhì)激素的功能。然而,皮質(zhì)醇對(duì)金錢魚(yú)滲透調(diào)節(jié)作用的生理機(jī)制尚不清楚清楚。為了解決這個(gè)問(wèn)題,我們通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得了皮質(zhì)醇受體GR和MR的cDNA全長(zhǎng)序列,為以后的研究做基礎(chǔ)。在本次研究中,將金錢魚(yú)飼養(yǎng)在不同的鹽度下(0,15,25,40)飼養(yǎng)7天。根據(jù)鹽度大小分別簡(jiǎn)稱為FW(fresh water)組,BW(brackish water)組,SW(sea water)組,HSW(high sea water)組。檢測(cè)了不同鹽度下鰓中NKA酶活性大小;利用滲透壓儀檢測(cè)不同鹽度下金錢魚(yú)血清滲透壓的大小;利用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中皮質(zhì)醇含量;利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)GR和MR mRNA在金錢魚(yú)滲透調(diào)節(jié)器官鰓腎中的表達(dá)水平變化;同時(shí)利用原位雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)皮質(zhì)醇受體GR和MR在海水和淡水金錢魚(yú)滲透調(diào)節(jié)器官鰓和腎中的表達(dá)。本研究主要結(jié)果如下:1.克隆獲得的GHR全長(zhǎng)2689bp,ORF框長(zhǎng)度1914bp,編碼667個(gè)氨基酸。包含8個(gè)半胱氨酸殘基,7個(gè)酪氨酸殘基以及3個(gè)糖基化位點(diǎn)。通過(guò)與其他硬骨魚(yú)氨基酸序列比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)金錢魚(yú)GHR在親緣關(guān)系與石斑魚(yú)最為接近。金錢魚(yú)IGF-I cDNA序列全長(zhǎng)2890bp,ORF框長(zhǎng)度為588bp,編碼186個(gè)氨基酸,包含11個(gè)半胱氨酸殘基,2個(gè)酪氨酸殘基。在親緣關(guān)系上與大黃魚(yú)最接近。2.RT-PCR結(jié)果顯示,在同一個(gè)鹽度下,垂體GH mRNA表達(dá)水平在采樣時(shí)間范圍內(nèi)無(wú)明顯變化;在不同鹽度分組內(nèi),垂體中GH mRNA表達(dá)水平差異顯著,與鹽度大小呈負(fù)相關(guān)。肝臟中GHR、IGF-I mRNA表達(dá)水平和鹽度呈正相關(guān),鹽度為35組表達(dá)最顯著,鹽度為25組其次,鹽度為2組表達(dá)水平最低。肝臟中GHR、IGF-I mRNA表達(dá)水平從4月到7月逐漸升高,8月呈現(xiàn)下降趨勢(shì),暗示了GHR和IGF-I mRNA的表達(dá)水平可能還受天氣溫度的影響。ELISA結(jié)果表明,血清中的GH含量和鹽度值大小成正比,鹽度為2組含量最低,鹽度為35組樣本中血清GH含量最高。在鹽度為2組中,血清中GH在4月到6月變化不顯著,在7月明顯升高,8月又呈現(xiàn)下降趨勢(shì);在鹽度為25組中血清中4-6月變化不顯著,6月開(kāi)始血清中GH含量開(kāi)始升高,升高趨勢(shì)一直延續(xù)到8月;鹽度為35組樣本血清GH含量4月到7月期間呈明顯提升趨勢(shì),變化顯著(P0.05),到8月表達(dá)含量又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。鹽度為2、25、35時(shí)金錢魚(yú)的SGR分別為0.68±0.12、0.44±0.08、0.23±0.06 g/d。各組間體重增量指數(shù)差異顯著,說(shuō)明并非所有能量都用于軀體生長(zhǎng),能量的大部分消耗在滲透調(diào)節(jié)方面。當(dāng)魚(yú)暴露在與內(nèi)部體液等滲的環(huán)境中時(shí),它們傾向于把較少的能量花在滲透調(diào)節(jié)上,從而把多余的能量分配給身體生長(zhǎng)。根據(jù)金錢魚(yú)體征數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出金錢魚(yú)在鹽度為2組內(nèi)生長(zhǎng)速度最快,平全長(zhǎng)度,平均體重均最高;鹽度為25組其次,在鹽度為35組中金錢魚(yú)生長(zhǎng)速度最緩慢。3.鰓中NKA酶活性大小以及血清滲透壓大小和鹽度呈正相關(guān)。RT-PCR結(jié)果顯示,MR和GR在鰓、腎中的表達(dá)情況類似,在BW組中表達(dá)最顯著,在FW組中表達(dá)水平最低,在SW和HSW組中表達(dá)水平接近。原位雜交結(jié)果表明,在鰓上皮細(xì)胞、和腎近端小管中均檢測(cè)到GR和MR雜交信號(hào)。此外,在海水中,GR和MR mRNA表達(dá)水平顯著高于淡水組�？偟膩�(lái)說(shuō),鰓和腎中GR和MR的存在證明了它們?cè)诮疱X魚(yú)滲透調(diào)節(jié)和體內(nèi)平衡過(guò)程中發(fā)揮重要作用,且兩者的作用類似。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 硬骨魚(yú)生長(zhǎng)內(nèi)分泌調(diào)控Fig1-1 Endocrine control of growth in the teleost fishH 的研究進(jìn)展長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）、催乳素（prolactin, PRL）以及生長(zhǎng)乳atolactin, SL）三者共同構(gòu)成 GH/PRL/SL 家族。三者具有相似的結(jié)構(gòu)且，因此有時(shí)被認(rèn)為同一類多肽激素。GH 在魚(yú)類中是一種由垂體嗜酸性的多肽類激素，在硬骨魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用[8-10]。在硬骨魚(yú)有多重作用，它能夠促進(jìn)繁殖[11]、調(diào)節(jié)滲透壓[12]、調(diào)節(jié)食欲[13]以及調(diào)節(jié)。H 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)類生長(zhǎng)激素是由魚(yú)類垂體分泌的一種由 173-188 個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋，分子量大小在 20000-22000 道爾頓[15]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，GH 的

所以在硬骨魚(yú)中稱為 HPI 軸。當(dāng)下丘腦受到外源應(yīng)激腺皮質(zhì)激素（corticotropin releasing hormone, CRH），C體合成并分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropin，液到達(dá)腎上腺皮質(zhì)區(qū)域，促進(jìn)腎上腺迅速合成皮質(zhì)醇，皮丘腦和垂體，形成反饋調(diào)節(jié)回路，從而形成下丘腦-垂體節(jié)系統(tǒng)。硬骨魚(yú) HPI 軸調(diào)控途徑如圖 1-2 所示。在大多數(shù)醇是由（HPA-I）軸產(chǎn)生的主要皮質(zhì)類激素，而在爬行動(dòng)是主要的皮質(zhì)類激素。皮質(zhì)醇的分泌受到多種應(yīng)激因素的熱休克以及毒物等。皮質(zhì)類固醇激素釋放的最主要的生理，該生理過(guò)程涉及到糖酵解和糖異生，使機(jī)體能夠應(yīng)對(duì)外[126]。，皮質(zhì)醇是由頭腎的腎間細(xì)胞分泌產(chǎn)生并釋放到血液中皮質(zhì)醇被認(rèn)為是唯一的生理活性形式。盡管在魚(yú)類中未檢白的存在（其他脊椎動(dòng)物中有檢測(cè)到），在一些研究中表低皮質(zhì)醇的生物利用率。

-1 金錢魚(yú)肝、鰓總 RNA 凝膠電泳圖K:肝； G: 鰓Fig 2-1 Gel of S. argus tissues RNAIGF-I 的中間片段我們?cè)O(shè)計(jì)出了表 2-1。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖 2-2.① ②

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