【摘要】：鰻弧菌(Vibrio anguillarum),隸屬于弧菌科(Vibrionaceae),是常見的水產(chǎn)動(dòng)物病原菌,可感染多種海水、淡水或半咸水魚類以及雙殼類和甲殼類動(dòng)物。鰻弧菌感染宿主引起高致死性的出血性敗血癥,嚴(yán)重危害著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。鰻弧菌血清型復(fù)雜,目前已知的血清型共23種(O1~O23),其中O1、O2和少部分O3血清型菌株為致病型,其余為環(huán)境株。流行病學(xué)調(diào)查顯示,O1、O2、O3血清型致病株均流行于我國海水養(yǎng)殖環(huán)境,嚴(yán)重危害著我國大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等海水魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。隨著魚類免疫學(xué)研究的不斷深入與疫苗免疫技術(shù)的不斷發(fā)展,魚用疫苗正逐漸取代抗生素成為水產(chǎn)動(dòng)物疫病防治的主流手段。1.本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下對(duì)鰻弧菌VAM003株生長條件進(jìn)行了初步優(yōu)化,采用單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)氯化鈉濃度、氮源種類及氮源添加量、碳源種類及碳源添加量進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)基中氯化鈉濃度應(yīng)不低于1%;氮源中胰蛋白胨促生長作用最佳,當(dāng)添加量為2%時(shí)菌產(chǎn)量達(dá)峰值;碳源中蔗糖促生長作用最佳,添加量為1.5%時(shí)菌產(chǎn)量達(dá)到峰值。2.本次實(shí)驗(yàn)在5 L發(fā)酵罐基礎(chǔ)上,以含2.5%氯化鈉的TSB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,以鰻弧菌VAM003株為對(duì)象,研究了二級(jí)種子液培養(yǎng)時(shí)間、發(fā)酵培養(yǎng)基氯化鈉濃度、二級(jí)種子液接種量、補(bǔ)料發(fā)酵,初步建立了發(fā)酵工藝:種子液按10%接種量接種到300 mL氯化鈉濃度為2.5%的TSB培養(yǎng)基,28℃,180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12~14h得二級(jí)種子液;按10%接種量將二級(jí)種子液接種到發(fā)酵罐,28℃,通氣攪拌培養(yǎng),發(fā)酵4 h后開始勻速添加補(bǔ)料葡萄糖,6 h后開始勻速添加補(bǔ)料10倍濃縮的TSB,發(fā)酵培養(yǎng)10~12 h后收獲菌液。隨后在500 L發(fā)酵罐進(jìn)行了放大培養(yǎng),培養(yǎng)10 h后菌液OD600值達(dá)最大值,此時(shí)菌液活菌數(shù)為12.0×10~9 CFU/mL。3.本實(shí)驗(yàn)對(duì)大菱鲆鰻弧菌滅活疫苗(VAM003株)中試產(chǎn)品進(jìn)行了免疫效力評(píng)價(jià),檢測了疫苗穩(wěn)定性、保存期、安全性、最小免疫劑量、對(duì)不同規(guī)格大菱鲆免疫保護(hù)效果、對(duì)同O1血清型其他菌株及O2、O3血清型菌株的交叉保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明疫苗穩(wěn)定性良好,不同生產(chǎn)批次疫苗免疫后28天RPS均達(dá)到100%,單劑量重復(fù)注射后也未有不良反應(yīng)產(chǎn)生,最小免疫劑量為0.025 mL/ind,對(duì)體重50 g以上的大菱鲆均有免疫保護(hù)作用,疫苗在4℃條件下至少可貯存18個(gè)月。4.本課題在鰻弧菌二價(jià)(O1/O2)滅活疫苗的基礎(chǔ)上以鰻弧菌VAM003(O1)、VAM007(O2)、M2016261(O3)為抗原制備了抗原濃度為10~8 cells/mL及10~9 cells/mL的鰻弧菌三價(jià)疫苗,將大菱鲆隨機(jī)分為2免疫組和1空白對(duì)照組,2免疫組以0.1mL/ind腹腔注射免疫大菱鲆即10~7 cells/ind組、10~8 cells/ind組,對(duì)照組注射相同劑量滅菌PBS。一次免疫60天后同法對(duì)10~8 cells/ind組進(jìn)行了一次加強(qiáng)免疫,并檢測了一次免疫后150天內(nèi)及同時(shí)期二次免疫大菱鲆對(duì)三種抗原的血清凝集效價(jià)和RPS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,一次免疫3天后可檢測到10~7 cells/ind組和10~8 cells/ind組大菱鲆抗鰻弧菌VAM003(O1)、VAM007(O2)、M2016261(O3)抗體,14天后兩免疫組(10~7 cells/ind、10~8 cells/ind組)VAM003、VAM007、M2016261抗體效價(jià)快速升高,28天后抗體效價(jià)均達(dá)到峰值1:248.89~1:320,顯著高于空白組(P0.05)。28~60天10~7 cells/ind組VAM003、VAM007、M2016261抗體效價(jià)保持在1:151.11~1:320,28~150天10~8 cells/ind組VAM003、VAM007、M2016261抗體效價(jià)保持在1:106.67~1:320。二次免疫3天后可檢測到二免組VAM003、VAM007、M2016261血清抗體效價(jià)均高于同期一免組,14天后顯著高于同期一免組(P0.05),隨后抗體效價(jià)均開始下降,60~90天血清效價(jià)與同期一免組無顯著差異(P0.05)。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,免疫7天后,10~7 cells/ind組和10~8 cells/ind組三種抗原的RPS在5.56~43.75%,14天后10~7 cells/ind組和10~8cells/ind組三種抗原的RPS均快速升高,28天后均達(dá)到最大值100%,60天后10~7cells/ind組VAM003下降至71.43%,其余均保持在70%及以上,10~8 cells/ind組RPS均保持在90%以上。120天后10~8 cells/ind組VAM003 RPS開始下降,150天后VAM003RPS下降到35%,VAM003下降到65%,而M2016261還保持在較高水平100%。二次免疫30~60天三種抗原RPS保持在80%以上,均不低于同時(shí)期一次免疫組,90天后VAM003 RPS下降到75%,VAM007、M2016261仍保持在80%以上。綜上所述,高劑量三價(jià)疫苗(10~9 cells/mL)抗體持續(xù)期為免疫后28~150天,若取RPS70%為有效免疫保護(hù)率,一次免疫后能為大菱鲆提供至少120天的免疫保護(hù)期,二次免疫后免疫保護(hù)期延長至150天。低劑量疫苗(10~8 cells/mL),抗體持續(xù)期及免疫保護(hù)期至少為60天。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S948
【圖文】：

MN MHK6 LSV7 SMW7 SMW5 SMW1 SMQ29 SMQ23（a）M5 VAM003 M1 LSV1 L70 2301 1703 0401

圖 4-2 鰻弧菌 O2、O3 血清型臨床株全菌抗原蛋白檢測Fig.4-2 The detection of total bacterial antigen protein in vibrio O2 & O3 serotype.4.3. 小結(jié)與討論魚用疫苗的研究始于上世紀(jì) 40 年代，70 年代首例商品化疫苗誕生。迄今為止，全球已有 140 余種疫苗獲得生產(chǎn)許可，美洲、歐洲、東亞等地區(qū)已建立工業(yè)化疫苗生產(chǎn)基地，在 Alpharma、Aqua Health、Intervet 和 Bayotek 等魚用疫苗領(lǐng)頭企業(yè)的帶動(dòng)下，不少國際制藥企業(yè)紛紛涉足魚用疫苗領(lǐng)域[2]。我國魚用疫苗的究起步雖晚，但發(fā)展速度較快，近 10 年魚用疫苗取得了不少研究進(jìn)展，但很少有疫苗制品進(jìn)入中試階段。本次實(shí)驗(yàn)參考獸用疫苗臨床試驗(yàn)申請(qǐng)要求，對(duì)大菱鲆鰻弧菌滅活疫苗（VAM003株）中試產(chǎn)品進(jìn)行了免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià)，從疫苗生產(chǎn)工藝即不同批次疫苗穩(wěn)定性、疫苗安全性、適宜免疫規(guī)格、最小免疫劑量、疫苗保存期及疫苗交叉保護(hù)作用對(duì)疫苗制品進(jìn)行了評(píng)估。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3 批大菱鲆鰻弧菌滅活疫苗（VAM003 株）中試產(chǎn)品免疫后 28 天 RPS 均達(dá)到 100%，表明疫苗生產(chǎn)工藝合理，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，符合批量

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 邢婧;王洋;宋曉青;唐小千;繩秀珍;戰(zhàn)文斌;;牙鲆(Paralichthys olivaceus)浸泡免疫鰻弧菌(Vibrio anguillarum)滅活疫苗后11種免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化[J];海洋與湖沼;2015年05期

2 楊麗;;嗜堿性類芽孢桿菌產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J];輕工科技;2015年04期

3 宋曉青;邢婧;戰(zhàn)文斌;;牙鲆經(jīng)注射和浸泡免疫鰻弧菌滅活疫苗后7種免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2014年04期

4 吳淑勤;陶家發(fā);鞏華;常藕琴;任燕;劉禮輝;陳總會(huì);賴迎迢;;漁用疫苗發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢[J];中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn);2014年01期

5 張士偉;黃建飛;羅立新;;枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J];中國釀造;2013年02期

6 石竹;劉琴;張智慧;楊敏俊;張?jiān)d;;基于斑馬魚模型的鰻弧菌減毒活疫苗的生物安全性評(píng)價(jià)[J];華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年06期

7 陶家發(fā);賴迎迢;任燕;康光輝;張悠;石存斌;吳淑勤;;弧菌菌株發(fā)酵工藝初步研究[J];工業(yè)微生物;2011年03期

8 閆茂倉;陳少波;單樂州;謝起浪;;海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病弧菌的研究進(jìn)展[J];水產(chǎn)科學(xué);2009年08期

9 潘燕華;馬悅;趙東玲;孫修勤;王啟要;吳海珍;張?jiān)d;;鰻弧菌減毒活疫苗對(duì)牙鲆免疫效果的研究[J];食品與藥品;2009年05期

10 陳吉祥;劉斌;池政豪;李筠;張曉華;;環(huán)境因子對(duì)鰻弧菌生長和胞外蛋白酶表達(dá)的影響[J];海洋科學(xué);2009年01期

本文編號(hào)：2739595