發(fā)布時間：2020-06-30 05:28

【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)作為中國重要淡水養(yǎng)殖珍珠的育珠貝,具有較高的經(jīng)濟價值,其所產(chǎn)珍珠顏色艷麗多彩,而珍珠顏色直接影響其價值。已有的研究表明,三角帆蚌珍珠顏色與黑色素生成有關(guān),同時也有研究在不同顏色珍珠中都發(fā)現(xiàn)了卟啉的存在,是影響珍珠致色的重要物質(zhì)之一。本研究是基于實驗室構(gòu)建的紫色、白色三角帆蚌家系為研究對象,篩選與珍珠層顏色相關(guān)的小眼畸形先關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因和尿卟啉原Ⅲ合成酶基因,研究其與三角帆蚌貝殼珍珠層呈色中的作用與影響。主要研究結(jié)果如下:1.三角帆蚌小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcMitf基因的克隆及其表達分析克隆得到三角帆蚌小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcMitf基因(GenBank:MH349354)cDNA全長2664bp,包含1332bp的ORF,編碼了443個氨基酸。HcMitf基因氨基酸序列包含一個螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(bHLH),沒有信號肽。組織定量檢測發(fā)現(xiàn),HcMitf基因在各個組織中廣泛表達,并且除了腸和閉殼肌外,與白色蚌相比,該基因在紫色蚌中的血液、外套膜、腎臟、鰓以及斧足中的表達極顯著(P0.01)。原位雜交實驗結(jié)論說明,HcMitf位于外套膜的背膜上皮細胞,并顯示出了陽性雜交信號。2.三角帆蚌小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcMitf基因的功能探究首先,利用RNAi技術(shù)探究HcMitf基因與下游HcTyr基因在黑色素合成過程中的作用。通過注射HcMitf的dsRNA干擾鏈,結(jié)果顯示:與空白對照組相較而言,陰性對照組的這兩個基因表達量均未有顯著變化,而實驗組的表達量降低了78%(p0.01),表明該干擾鏈成功抑制了HcMitf基因的表達,干擾效果較好,同時下游基因HcTyr表達也極顯著降低。與此同時,總黑色素含量測試表明,實驗組的外套膜總黑色素含量顯著低于空白對照組。其次通過插片手術(shù),探究了HcMitf和HcTyr在三角帆蚌珍珠早期發(fā)育過程中的表達變化及其相關(guān)性。在插片手術(shù)后,HcMitf和HcTyr的表達均在6h達到了頂峰,并且在96h回到正常值。隨后HcMitf在14d表達量相較于正常值又有顯著提高,而HcTyr表達量則在35d有了顯著差異。同時通過correl函數(shù)將這兩個上下游基因的表達量進行線性相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)兩者具有相關(guān)性(R=0.919)。3.三角帆蚌尿卟啉原Ⅲ合成酶HcUros基因的克隆及其表達分析通過分子克隆技術(shù)得到HcUros基因(GenBank:MK599473)cDNA全長1448bp,包含858bp的ORF,一共編碼了285個氨基酸,沒有信號肽。經(jīng)熒光定量檢測發(fā)現(xiàn),HcUros基因在紫白色蚌各個組織中表達較為廣泛,并且該基因在紫色蚌中的表達量都高于白色蚌中的表達量,并且與白色蚌相比,在紫色蚌的外套膜和血液中的表達量顯著(P0.01)。原位雜交定位實驗結(jié)果顯示,HcUros位于外套膜的背膜上皮細胞,出現(xiàn)陽性雜交信號。4.三角帆蚌尿卟啉原Ⅲ合成酶HcUros的功能探究首先通過RNAi技術(shù)探究HcUros基因與下游HcPpo基因在卟啉合成途徑中的調(diào)控關(guān)系。通過注射HcUros的dsRNA干擾鏈,結(jié)果顯示:與空白對照組相比,陰性對照組中HcUros的表達量未有明顯的變化,而實驗組的表達量降低了62.5%(p0.01),表明該干擾鏈成功抑制了HcUros基因的表達,干擾效果較好,同時下游基因HcPpo表達也顯著降低。其次通過插片手術(shù)來研究HcUros在三角帆蚌珍珠早期發(fā)育時期中的參與調(diào)控。在插片實驗后,HcUros的表達量在3h顯著降低后一直到48h和96h又顯著升高,7d又回到正常值,最后在28d表達量達到峰值。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 2-1：左圖為紫色三角帆蚌的內(nèi)殼色，右圖為白色。Fig2-1;Inner shell color of H. cumingii. Left:The purple (P-) mussel line; Right: white (W-).2.1.1.2 實驗儀器設(shè)備儀器名稱 儀器來源微量移液器 德國 Eppendorf 公司高速冷凍離心機 德國 Eppendorf 公司連接儀 德國 Eppendorf 公司HVE-50 型高壓滅菌鍋 日本 Hirayama 公司液氮 成都金鳳液氮容器有限公司NanoDrop 2000C 型 OD 儀 美國 Thermo Fisher Scientific 公司BS124S 型多功能精密電子天平 德國 Sartorius 公司超純水儀 Millipore 公司電泳槽 北京六一儀器廠

上海海洋大學碩士學位論文Fig.2-2：Full-length nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the HcMitf (Geneaccession is MH349354). The gray box indicates the predicted basic helix-loop-helix (bHLH)domain and the predicted polyadenylation signal AATAAA is underlined.2.2.2 多重比對與系統(tǒng)進化樹分析使用 ClustalW 軟件進行多重序列比對分析（圖 2-3A），選取不同物種中的MITF 與獲得的 HcMitf 進行比對，發(fā)現(xiàn)它們之間有著較高的相似度。用 MEGA5.2將不同物種的 MITF 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖 2-3B），根據(jù)結(jié)果顯示，HcMitf與中華文蛤（Meretrix petechialis）親緣關(guān)系最近。

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