【摘要】：仿刺參[Apojtichopus japonicus,(Selenka,1867)]是我國海洋重要養(yǎng)殖經(jīng)濟動物,長期以來我國仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)一直在北方地區(qū)開展,但目前仿刺參的人工養(yǎng)殖出現(xiàn)南移趨勢,隨著南方養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴大,養(yǎng)殖管理的不規(guī)范,導致仿刺參爆發(fā)病害,其中,腐皮綜合征是目前南方仿刺參養(yǎng)殖過程中最常見的疾病。南方夏季水溫高,仿刺參免疫力下降,此時最易發(fā)病,在病害爆發(fā)時可導致大規(guī)模個體死亡,嚴重威脅著我國南方仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。本研究致力于明確南移養(yǎng)殖度夏仿刺參腐皮綜合征的病原菌,建立病原菌的快速鑒別技術;同時結(jié)合分子生物學技術研究腐皮綜合征病原菌入侵仿刺參時的免疫防御機制,特別是分離腐皮綜合征病原菌誘導下的差異表達基因,了解其表達模式,探討腐皮綜合征病原菌的誘導和免疫相關基因的關系,為克隆免疫相關基因創(chuàng)造條件,深入闡述仿刺參的免疫防御機制和培育抗病新品種奠定基礎。主要結(jié)果如下:1.從患有腐皮綜合征的度夏仿刺參上分離純化獲優(yōu)勢菌株,人工回接感染實驗驗證其為病原菌。利用注射感染和浸浴感染兩種方式了解該病原菌對仿刺參的致病性,發(fā)現(xiàn)兩種方式均能誘導發(fā)病,從而證明了本實驗分離的菌株對仿刺參具有較強致病性。綜合采用3種方法全面了解病原菌的特征并加以鑒定,確定該病原菌為伯麥羅弧菌(Vibrio pomeroyi Thompson etal,2003)。研究表明,基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術準確、便捷、重復性高,非常適合于傳統(tǒng)鑒定方法易混淆的弧菌種類鑒別,可作為病原菌快速鑒別的方法。2.將本次實驗獲得的伯麥羅弧菌菌株V.pomeroyiSUS與分離自巴西海域的V.pomeroyi LMG20537T(典型菌株)以及分離自彼得大帝灣的V.pomeroyi 929進行比較,結(jié)果表明來自不同海域的菌株對鹽度和溫度的耐受性與其生長的環(huán)境密切相關,表現(xiàn)出不同海域間的明顯差異,其中采自夏季福建海域的V.pomeroyi SUS相對其他2個菌株對高溫具有較好的耐受性;來自于巴西圣卡塔琳娜州鹽度較高海域的的典型菌株V.pomeroyi LMG20537.T與另2株采集自鹽度相對較低海域(福建莆田、彼得大帝灣)的菌株相比,對鹽度具有較高的耐受性,能在含8%NaCl培養(yǎng)基上生長。3.采用抑制性消減雜交技術,以仿刺參體內(nèi)承擔主要免疫作用的體腔細胞為材料,構(gòu)建了仿刺參經(jīng)伯麥羅弧菌誘導的抑制性差減雜交cDNA文庫。文庫中的808個陽性克隆提取質(zhì)粒后測序,共得到806條高質(zhì)量序列,聚類后共獲得318個unigene。對基因進行GO分類,發(fā)現(xiàn)GO分類為生物過程的unigene數(shù)量最多,細胞組分和分子功能的unigene數(shù)量比較持平。在細胞組分注釋類別下,以細胞組成(cellpart)最多;在分子功能類中蛋白質(zhì)結(jié)合功能(protein binding)最多;而在生物過程中,生物學調(diào)節(jié)過程(regulation of biological process)是包含差異基因最多的類別。4.據(jù)生物信息學分析結(jié)果,篩選出C型凝集素(contig116和contig17)、含鐵蛋白(B07和H0 1)和血清樣淀粉蛋白A(contig96)5個與免疫相關的ESTs。利用熒光實時定量PCR技術研究仿刺參5個ESTs在伯麥羅弧菌誘導下的差異表達,結(jié)果表明:C型凝集素由于種類不同,在病原菌誘導后在體腔細胞中隨時間推移其表達量的變化模式不同;但在病原菌誘導后24h,兩者在不同組織/器官中的表達分布模式比較一致,均在體腔細胞中表達量最高,體壁組織中表達量最低,contig17在體壁組織中甚至沒有表達。血清淀粉樣蛋白A在病原菌誘導后24h出現(xiàn)上調(diào),48h轉(zhuǎn)而下降,根據(jù)該蛋白的特性,我們可推斷伯麥羅弧菌誘導48h后已不屬于仿刺參對病原菌反應的急性期。含鐵蛋白包括鐵蛋白(B07)和核糖核苷酸還原酶(H01),前者于病原菌誘導后在呼吸樹中的表達量最高;后者則在體腔細胞中表達量最高,呼吸樹次之。兩者在病原菌誘導后時間序列上的表達模式也不同,鐵蛋白在24h出現(xiàn)下調(diào),而核糖核苷酸還原酶卻在24h出現(xiàn)上調(diào)�？梢姾F蛋白不僅具有氧的運輸和電子轉(zhuǎn)運功能,同時也與免疫防御息息相關。
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ｉ窗２３ＳｉＨＫＡ護瓠？片《」逡逑Ｊ．邋２１－３８．邋６１邋１ＪＪ－Ｉ３２：邋１：邋Ｉ８Ｓ－２３Ｓ．邐＜Ｃ２￣＜３７邋９．邋４４｜－４ａ）邋ＪＣ，４５６￣４Ｗ逡逑圖１－２細菌１６Ｓ？２３ＳｒＲＮＡ基因（ＩＴＳ）的結(jié)構(gòu)（李鵬等，２００８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋１６Ｓ－２３Ｓ邋ｒＲＮＡ邋（ＩＴＳ）逡逑細菌的１６ＳｒＲＮＡ基因全長約為１．５邋Ｋｂ，在目前的測序技術下，該長度非常適逡逑于測序；具有多個保守區(qū)域，并且和變異片段兩者互相交錯排列，保守性可反映逡逑物種之間的親緣關系，高變性則揭示不同菌屬之間的差異，是屬種鑒定的分子基逡逑礎（Ｒｅｉｍａｎ，１９９９）。逡逑研[傊惺紫然竦檬笛槎韻蟮模保叮渝澹潁遙危列蛄行畔�，再利用n蹋粒櫻緣裙ぞ哂爰哄義現(xiàn)諳呤菘庵械男蛄行畔⒔釁ヅ洌ê橐騫齲玻埃埃玻誨澹茫歟幔潁潁椋洌紓澹澹簦幔歟澹玻埃埃矗哄義戲胂嫉齲玻埃埃擔�。磦蝤可有效抵\榷猿鑫粗艫木輳�，臍ぐ可提供１６Ｓ邋}遙危鈴義匣蛐蛄薪斜榷緣氖菘獍ǎ海牽澹睿攏幔睿牘彩菘�、秧ａ}簦牽澹睿迨菘夂灣義希停椋悖潁錚櫻澹襠桃禱菘獾榷喔鍪萏峁┬蛄欣叢礎＃牽澹睿攏幔睿朧菘饈褂寐首罡

本文編號：2657506