【摘要】：殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida,A.salmonicida),作為最主要的一種可以引起魚體癤瘡病的細(xì)菌,正影響著全世界范圍內(nèi)的鮭科魚類的養(yǎng)殖,尤其是大西洋鮭(Salmo salar)的養(yǎng)殖。為了增加我們對這個病原菌的了解,同時從大西洋鮭體內(nèi)篩選出可以用來抵抗該病菌侵襲的潛在生物指示因子,我們采用代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)學(xué)和分子生物學(xué)的方法進(jìn)行實驗分析和篩選。由于該細(xì)菌主要發(fā)病的器官是魚體的重要免疫器官-腎臟組織。因此,我們將腎臟作為本實驗研究的主體。另外,我們從實驗分析的組學(xué)數(shù)據(jù)中篩選出醛脫氫酶家族的7A1蛋白(ALDH7A1),并將其進(jìn)行蛋白重組表達(dá)純化。發(fā)現(xiàn)其在大西洋鮭感染殺鮭氣單胞菌的早期,有著明顯的抗殺鮭氣單胞菌的能力并且可以顯著降低魚體的死亡率。所有得到的主要結(jié)果如下所示:1代謝組學(xué)對感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析本部分實驗中,我們首次通過~1H核磁共振(NMR)光譜分析法來分析感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織中代謝物的變化情況。通過NOESYPR1D光譜、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析模型(OPLS-DA)兩種多元化分析(劉鵬飛,2015),對7天和14天的高濃度感染實驗組與對照組中的實驗大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行比較分析。本部分實驗最主要的目的就是篩選出可以抵抗殺鮭氣單胞菌感染魚體的重要代謝物,同時進(jìn)一步了解該病菌在大西洋鮭體內(nèi)的致病機理。經(jīng)分析,我們發(fā)現(xiàn)分布在TCA循環(huán)、糖酵解/糖異生、色氨酸代謝和尿素循環(huán)等四大代謝通路中的延胡索酸鹽、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、天冬氨酸鹽、膽堿、磷酸膽堿和甜菜堿等9種差異代謝物,可能是由于殺鮭氣單胞菌的刺激和影響,而在魚體內(nèi)出現(xiàn)明顯增高的表達(dá)趨勢。2蛋白質(zhì)組學(xué)對感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析本部分實驗通過高通量蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ標(biāo)記法),對在7天和14天兩個高、低濃度不同的感染殺鮭氣單胞菌的實驗組中的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析和鑒定。我們通過LC/MS/MS質(zhì)譜儀分析后共篩選出4009個總蛋白。隨后,我們將140個差異極顯著的蛋白(差異倍數(shù)≥1.5和P0.01)進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析,共篩選出39個蛋白可以作為大西洋鮭抵抗殺鮭氣單胞菌侵襲的潛在生物指示因子。然后,我們從中篩選了9個重要的差異蛋白進(jìn)行實時定量PCR來檢驗這些基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與蛋白水平變化基本相同。本實驗是第一次通過iTRAQ技術(shù)對感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析鑒定,最終我們推測甘油醛-3-磷酸脫氫酶、醛脫氫酶家族7A1、醛脫氫酶家族9A1、L-乳氨酸脫氫酶B鏈、羥烷基-輔酶A脫氫酶、β-血紅蛋白亞基、α-4-血紅蛋白亞基、T-復(fù)合蛋白1-eta亞基、磷酸丙糖異構(gòu)酶-A和補體因子B等10個蛋白可作為潛在的生物指示因子進(jìn)行深入研究。3 ALDH7A1蛋白可以保護(hù)大西洋鮭抵抗殺鮭氣單胞菌醛脫氫酶家族(ALDHs)是一個具有解毒功能的超級蛋白家族,同時該家族蛋白在維持上皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),并保護(hù)細(xì)胞免受醛類毒素的影響和抗藥性上有著重要的作用。然而,對于這些解毒蛋白如何行使功能,我們至今還無從得知。在本部分的研究中,我們表達(dá)并純化了ALDH7A1蛋白來研究其在感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭時的作用。我們首先通過SDS-PAGE和western blot的方法來驗證重組表達(dá)的ALDH7A1(rALDH7A1)蛋白。該蛋白分子量大概為58.9 kDa,等電點為7.09,且該重組蛋白并無信號肽分子,而氨基酸序列中只有一個低復(fù)雜區(qū)域(~14141 yvegvgevqeyvdv ~(153))。另外,ELISA的結(jié)果表明,rALDH7A1可以與殺鮭氣單胞菌結(jié)合。且ALDH7A1的基因在魚的腎臟、肝臟、腸、和血液中表達(dá)最高(依次降低),而在鰓和脾中表達(dá)最低。隨后再通過實時熒光定量PCR檢驗大西洋鮭的腎臟組織后,我們發(fā)現(xiàn)注射rALDH7A1蛋白的感染殺鮭氣單胞菌的實驗組中,在感染早期,殺鮭氣單胞菌的拷貝數(shù)明顯低于同濃度的感染實驗組。與此同時,我們測定了在腎臟和脾臟組織中,NF-kB、P-38 MAPK、caspase-3和TNF-α等4個基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,主要在72 h的rALDH7A1+高/低濃度感染組的腎臟和肝臟中,這4個基因受到rALDH7A1蛋白的作用表達(dá)量明顯高于其他實驗組,而在脾臟組織中則是在12 h時,在rALDH7A1+高/低濃度感染組中出現(xiàn)與72 h相同的變化趨勢。再通過體內(nèi)中和實驗,我們發(fā)現(xiàn)rALDH7A1+高/低濃度感染組中的魚與BSA和PBS對照組相比,魚的死亡率會降低并出現(xiàn)明顯延后致死的情況。4磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)對感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析本部分實驗通過磷酸化蛋白質(zhì)組對感染細(xì)菌時顯著差異表達(dá)的蛋白的磷酸化位點進(jìn)行分析。這是首次對感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭進(jìn)行磷酸化位點的鑒定。經(jīng)分析,共有3112個蛋白含5635個磷酸化位點被鑒定到,并以1.5倍差異倍數(shù)為基礎(chǔ),共鑒定到1502個上調(diào)蛋白和77個下調(diào)蛋白。再結(jié)合之前得到的蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)以及基序(motif)分析,我們推測5個在免疫過程和細(xì)胞通路中調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨架的激酶(VRK3,GAK,HCK,PKCδ和RSK6)可以作為研究大西洋鮭抵抗殺鮭氣單胞菌侵襲的潛在生物因子。另外,通過蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖分析,我們發(fā)現(xiàn)fga在整個蛋白網(wǎng)絡(luò)的最中心部位,同樣可能在感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭體內(nèi)起著重要的調(diào)控作用。
【圖文】：

圖 1.1 感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的癥狀。Fig. 1.1 Symptom in Atlantic salmon infected by A. salmonicida.1.2. 殺鮭氣單胞菌在大西洋鮭中的研究進(jìn)展1.2.1. 殺鮭氣單胞菌致病機制研究之前有研究表明，III 型分泌系統(tǒng)（TTSS）是引起殺鮭氣單胞菌在大西洋鮭中致病性毒力因子（Burr et al.，2002；Dacanay et al.，2003；Dacanay et al.，2006；Vipond et al.，，1998）。TTSS 主要是通過產(chǎn)生一種效應(yīng)因子，將細(xì)菌從細(xì)胞質(zhì)中直接導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的胞液中（He et al.，2004）。隨后，當(dāng)攜帶 TTSS 細(xì)菌與宿主中的巨噬細(xì)胞相結(jié)合后，該效應(yīng)因子可以抑制巨噬細(xì)胞細(xì)胞信號通路，從而

多組學(xué)研究大西洋鮭抵御殺鮭氣單胞菌的分子機制(4) 通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，對高濃度（107CFU/mL）感染殺鮭氣單胞菌 7 天時的大西洋鮭的感染組和對照組的腎臟組織進(jìn)行比較，篩選出感染組中重要的磷酸化差異蛋白質(zhì)和磷酸化位點。本文的技術(shù)路線如圖 1.2 所示。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S941.42

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本文編號：2635533