發(fā)布時間：2020-04-18 12:49

【摘要】：造血作用是指未成熟的血淋巴細胞分化為成熟的血細胞和淋巴細胞的過程,其對動物生存起到至關重要的作用。周期蛋白依賴激酶(CDKs)是細胞周期調節(jié)過程中的核心分子,參與調節(jié)高等動物的細胞分裂,細胞分化,配子形成等生命過程,其與造血系統的互作網絡引起研究人員的廣泛關注。目前研究發(fā)現,周期蛋白依賴激酶在無脊椎動物中同樣發(fā)揮著重要的作用,但其對無脊椎動物,尤其是甲殼動物造血過程調控方面的研究十分有限。本論文從甲殼動物的造血過程入手,利用生物化學,細胞生物學,分子生物學等技術手段,以中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)為研究對象,克隆得到了EsCDK2的c DNA序列,分析了其組織與細胞分布特征和對造血刺激的響應模式,對EsCDK2的造血調節(jié)機制開展了初步研究。從中華絨螯蟹中鑒定得到一個含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶結構域的周期蛋白依賴激酶分子EsCDK2,并對其分子序列及組織分布特征進行了分析。EsCDK2的cDNA序列全長2405 bp,含有一個909 bp的開放閱讀框,編碼302個氨基酸。EsCDK2氨基酸序列與其他物種已知的CDK2序列同源性較高,序列相似度為66%-81%。分子進化分析表明,EsCDK2能與斑節(jié)對蝦中的CDK2聚為一簇,其親緣關系較近。qRT-PCR檢測發(fā)現,EsCDK2的mRNA表達量在血淋巴細胞中最低,在心臟和肌肉中表達量較低,而在造血組織和性腺中的表達量較高,分別是血淋巴細胞中表達量的141倍和87倍。通過免疫組化法進行亞細胞定位發(fā)現,EsCDK2在造血組織細胞的細胞核和胞漿中均有分布。中華絨螯蟹造血組織細胞中Es CDK2的mRNA表達量在脂多糖(2.02倍,p0.05)和嗜水汽單胞菌(2.31倍,p0.05)刺激3小時后顯著上升。血淋巴細胞總數在抽血刺激0.5小時后顯著降低(0.39倍,p0.05),達到0.42×10~7個/毫升,之后逐漸上升并在6小時恢復至正常水平。利用RNA干擾技術研究了Es CDK2對于造血組織細胞增殖的影響。注射Es CDK-dsRNA后24小時,造血組織中EsCDK2的mRNA表達量顯著降低(0.53倍,p0.01);造血組織細胞中新生血細胞占比由37.7%降至16.3%(0.43倍,p0.01),表明隨著EsCDK2被抑制,造血作用顯著減弱。利用流式細胞儀對造血組織細胞進行細胞周期分析發(fā)現,注射EsCDK2-dsRNA后處于G0-G1時期的細胞占比顯著上升至85.01%(1.26倍,p0.01),而處于S期和G2-M期的細胞占比分別顯著下降至7.92%(0.46倍,p0.01)和7.07%(0.43倍,p0.01),表明Es CDK2表達被抑制后造血組織細胞的細胞周期在G1期出現阻滯。綜上,EsCDK2在結構上與高等動物的CDK2相似度較高,主要在造血組織細胞和性腺細胞中表達。在免疫刺激和抽血刺激后,中華絨螯蟹血細胞總數顯著降低,造血組織中EsCDK2的m RNA表達量顯著上升。EsCDK2被干擾后,血細胞總數和新生血細胞數均顯著降低,且造血組織細胞的細胞周期在G1期發(fā)生阻滯,表明EsCDK2通過調節(jié)造血組織細胞由G1期向S期轉變,參與調節(jié)中華絨螯蟹的造血過程。研究結果對深入探索甲殼動物免疫系統的組成和造血作用的調節(jié)機制具有重要的指導意義。
【圖文】：

CDKs 在進化上是高度保守的，從低等的真核生物酵母到高等哺乳動物人依賴 CDKs 對細胞周期進行調控，但不同生物細胞周期的調控機制相差很如，酵母中只有一種 CDK，而人類以及其他哺乳動物中則有多個 CDK 分子胞周期的不同階段發(fā)揮作用。雖然 CDK 的數量不同，但細胞周期的基本調則是相同的，即 CDK 分子與周期蛋白結合發(fā)揮細胞周期調節(jié)作用，因此 CD泛存在于各個物種當中(Lim and Kaldis, 2013)。1.2 CDKs 的分子結構作為典型的 CMGC 激酶家族成員，CDK 屬于脯氨酸引導的絲氨酸/蘇氨白激酶。由于其結合脯氨酸的位點附近存在疏水口袋結構，所以 CDK 序列常含有 S/T-P-X-K/R 序列。但 CDK4 分子中不存在疏水口袋結構，因此其序無上述特征序列；CDK7 和 CDK9 并不是脯氨酸引導的絲氨酸/蘇氨酸蛋白，因此它們可以不依賴脯氨酸而行使磷酸化底物的功能(Echalier et al., 201

第一章 緒論CDKs 的氨基酸序列長度范圍從大約 250 個氨基酸殘基，與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域大小相當，到 1500 個氨基酸殘基，除絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域外還擁有不同的 C 端和 N 端序列（圖 1.1）。與其他激酶一樣，CDK 具有雙葉結構，，N 端葉含有大量的 β 折疊，而 C 端葉富含 α 螺旋，活性位點位于兩葉中間。除此之外，其 N 端葉包含一個富含甘氨酸的抑制元件和一個 C 螺旋，其 C端則包含激活元件，例如 CDK2 中的 DFG 結構域，APE 結構域和磷酸化位點T160(De Vivo et al., 2011)。當 CDK 未結合周期蛋白時，其活性區(qū)域被 T 螺旋關閉，因此不具有激酶活性；當 CDK 與周期蛋白結合后，其活性區(qū)域打開，CDK具有了磷酸化底物的活性（圖 1.2）。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院海洋研究所)
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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1 Hai-sheng XU;Sun-jian LYU;Jie-hao XU;Bin-jie LU;Jing ZHAO;Song LI;Yi-qun LI;Yu-yin CHEN;;脂多糖對中華絨螯蟹血細胞凋亡影響的研究(英文)[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年12期

2 史惠蓉;張瑞濤;;P53、P21~(WAF1)和CDK1在卵巢上皮性癌組織中的表達及意義[J];癌癥;2009年08期

本文編號：2632108