發(fā)布時(shí)間：2020-04-14 22:29

【摘要】：日本海馬（Hippocampus japonicus）在試驗(yàn)室養(yǎng)殖過程得了潰瘍癥，其主要癥狀表現(xiàn)為皮膚潰爛、肝臟糜爛、腸道發(fā)白或透明等，不及時(shí)隔離治療會(huì)導(dǎo)致全部死亡。本研究的目的是分離和鑒定日本海馬潰瘍癥的病原。從患有潰瘍癥的瀕死日本海馬的皮膚潰爛部位、肝臟等分離病原菌；通過形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)病原菌進(jìn)行分類鑒定；通過藥敏試驗(yàn)來確定該病原菌對(duì)抗生素的敏感性；通過人工感染試驗(yàn)來確定該菌對(duì)日本海馬的致病性；從病變?nèi)毡竞ｑR分離得到兩株優(yōu)勢(shì)菌分別為HM16和HC2；綜合菌株HM16和HC2的形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析等方面的試驗(yàn)結(jié)果，分別確定HM16為弧菌屬(Vibrio sp.)細(xì)菌和HC2為假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）細(xì)菌。人工感染試驗(yàn)證實(shí)HM16和HC2均為日本海馬的病原菌，HM16和HC2對(duì)日本海馬的半數(shù)致死劑量（LD50）分別為7.9×102cfu/g（魚）和1.6×103cfu/ind（魚）。HM16對(duì)頭孢他啶、菌必治、鏈霉素、氯霉素和紅霉素等表現(xiàn)出強(qiáng)敏感性；HC2對(duì)氨芐青霉素、羧芐青霉素、氧哌嗪青霉素、復(fù)達(dá)欣、菌必治、新霉素和氧氟沙星等表現(xiàn)出強(qiáng)敏感性。 從健康日本海馬（H. japonicus）腸道內(nèi)分離獲得對(duì)其腸炎病病原菌HC2具有顯著拮抗作用的菌株，優(yōu)化其產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件，為海馬生物防治奠定基礎(chǔ)。采用點(diǎn)種法并以日本海馬腸炎病病原菌HC2為指示菌，對(duì)從健康日本海馬腸道內(nèi)分離的56株細(xì)菌進(jìn)行體外拮抗試驗(yàn)。根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。通過最優(yōu)培養(yǎng)基成分的選擇、培養(yǎng)基組分的正交試驗(yàn)優(yōu)化和單因素試驗(yàn)來確定優(yōu)化發(fā)酵條件。從日本海馬腸道內(nèi)篩選出一株拮抗菌，編號(hào)為HS17。綜合該菌的形態(tài)、生理生化以及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方面的試驗(yàn)結(jié)果，確定菌株HS17屬于芽孢桿菌屬(Bacilus sp.)。該菌生長的最佳碳源、氮源和磷酸鹽分別為蛋白胨、麥芽糖和KH2PO4；其最佳發(fā)酵配方和發(fā)酵條件為蛋白胨(20.0g/L)、麥芽糖(10.0g/L)、KH2PO4(1.5g/L)、NaCl(10.0g/L)和MgSO4·7H2O(0.2g/L)，初始pH為7.0，接種量為3%，裝瓶量為30mL/100mL，轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48h。通過發(fā)酵條件優(yōu)化后菌株HS17對(duì)病原菌HC2的抑制效果更加明顯。 組織病理學(xué)研究表明：病變?nèi)毡竞ｑR的表皮完全脫落，結(jié)締組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形，并產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)；尾部潰爛部位，軟骨嚴(yán)重?fù)p傷，肌肉濃縮，細(xì)胞核出現(xiàn)凝聚，且產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)；皮膚的色素層脫落，且分散在真皮層的黃色色素細(xì)胞和紅色色素細(xì)胞消失；肝臟內(nèi)血管破裂，出現(xiàn)紅細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，并出現(xiàn)大量空泡，肝細(xì)胞之間出現(xiàn)斷裂，肝細(xì)胞破壞，細(xì)胞核游離，且肝細(xì)胞產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)。
【圖文】：

圖 2-1 菌株 HM16 的電鏡照片F(xiàn)igure 2-1 The electron micrograph of strain HM166 的生長溫度范圍為 10℃～45℃，最適生長溫度為 25℃NaCl）范圍為 0.5%～11%，最佳絕對(duì)鹽度（NaCl）為 1 5～10，最適 pH 為 6～8。特征鑒定結(jié)果6 在麥康凱培養(yǎng)基上可以生長，在綿羊血平板上呈 β 型脂酶（Tween80）、卵磷脂酶試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；酪蛋白基紅、VP 試驗(yàn)結(jié)果均為陰性（表 2-1）。依據(jù) API 20E表比對(duì)結(jié)果可知，菌株 HM16 屬于弧菌屬（Vibrio sp.），E 試劑條鑒定結(jié)果見表 2-1。

圖 2-2 16S rDNA 基因序列的 NJ 法構(gòu)建菌株 HM16 的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure2-2 Phylogenetic tree of strain HM16 based on 16S rDNA gene sequences. The numbers athe nodes indicate the bootstrap values based on neighbor-joining analyses of 1000 sample datesets. Bar, 0.002 substitutions per nucleotide position. The numbers in parentheses are accessionnumber of sequences.2.2.7 人工感染試驗(yàn)結(jié)果腹腔注射感染后，日本海馬的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀較為相似。當(dāng)菌株HM16 濃度≥5.3×108cfu/mL 時(shí)，日本海馬在第 1 天就開始死亡，死亡癥狀為頸部和軀干部體表發(fā)白并開始潰爛，肝臟糜爛等，3d 內(nèi)死亡率為 100%；當(dāng)菌注射濃度≥5.3×106cfu/mL 時(shí)，日本海馬在第 4d 出現(xiàn)死亡，，詳情見表 2-3。從感染死亡的日本海馬的潰爛的軀干部皮膚和肝臟等，再次分離、純化優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)生理生化和 16rDNA 鑒定，確定就是菌株 HM16。按照 Probit 法計(jì)算出菌株 HM16 對(duì)日本海馬半數(shù)致死量（LD50）為 7.9×102cfu/g（魚）（9.9×102cfu/ind）。
【學(xué)位授予單位】：魯東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S947.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2627782