【摘要】：本文通過(guò)對(duì)WSSV囊膜VP110序列進(jìn)行blast和alignment分析后發(fā)現(xiàn),vp110和pif2有相似性,而pif2是桿狀病毒經(jīng)口侵染因子。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn),VP110和PIF2均在N端有高疏水性區(qū)域,且為跨膜區(qū)。我們將WSSV VP110與昆蟲(chóng)DNA病毒Baculoviruses、Nudiviruses、Hytrosaviruses等的PIF2蛋白序列最相似的,不包含疏水性較高的N端區(qū)域的150到600aa定義為s VP110,將其基因序列克隆到p ET-16b表達(dá)載體上。對(duì)表達(dá)條件如溫度、時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,高表達(dá)無(wú)斷裂的融合蛋白s VP110-His,經(jīng)GE蛋白純化儀AKTA Pure系統(tǒng)純化后,蛋白純度達(dá)到80%以上。復(fù)性條件經(jīng)過(guò)不斷探索、優(yōu)化后,選擇了最佳復(fù)性條件6 mol/L的尿素溶液4℃透析1 h,接著使用4 mol/L尿素溶液透析4 h,最后用2 mol/L尿素溶液透析2 h,成功完成透析復(fù)性。使用超濾管超濾濃縮復(fù)性成功的蛋白s VP110-His,得到高濃度、高親水性的s VP110-His蛋白,濃度達(dá)到600.83 mg/m L,總量完全滿足制備兔源多克隆抗體的要求(≥3mg)。將制備成功的融合蛋白s VP110-His作為抗原免疫兔子,成功的制備出特異性高,親和性好的多克隆抗體,抗體的效價(jià)達(dá)到1:23,000。這為進(jìn)一步驗(yàn)證WSSV的經(jīng)口侵染以及VP110與圍食膜蛋白的相互作用打下了基礎(chǔ)。我們將VP110功能區(qū)域(150aa-610aa)構(gòu)建到載體p QE80-ZZtev、p ET-16b、p GEX-4T1和p ET-32a,經(jīng)過(guò)對(duì)原核表達(dá)的條件的摸索:如改變誘導(dǎo)溫度、嘗試低溫表達(dá)、誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)及縮短、誘導(dǎo)劑濃度的摸索(1 mmol/L、0.1 mmol/L);嘗試不同的表達(dá)菌株BL21、Rosetta和Origami B;最終用N端帶有提高蛋白可溶性的硫氧還原蛋白標(biāo)簽和兩端均有用于純化的his標(biāo)簽的p ET-32a載體,成功的表達(dá)出可溶性融合蛋白s VP110-Trx,并對(duì)其進(jìn)行了純化優(yōu)化摸索,得到可溶性的融合蛋白s VP110-Trx。本文在研究過(guò)程中,嘗試表達(dá)VP110全長(zhǎng)蛋白。選用了不同的表達(dá)載體、不同表達(dá)菌株,并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,VP110全長(zhǎng)以包涵體形式表達(dá)。上清中含量極微或者完全檢測(cè)不到。三種表達(dá)菌株BL21、Rosetta和Origami B中,Rosetta的表達(dá)能力最好,BL21次之,Origami B最差。三株菌的最適表達(dá)條件均為1 mmol/L的IPTG和30℃的誘導(dǎo)溫度。三個(gè)不同標(biāo)簽的表達(dá)載體p GEX-4T1、p ET-16b、p ET-32a中,p ET-32a的融合蛋白VP110-Trx的表達(dá)量在同樣條件下最高,p ET-16b的融合蛋白VP110-His的表達(dá)量次之,p GEX-4T1的融合蛋白VP110-GST表達(dá)量最低。盡管優(yōu)化表達(dá)后,VP110始終以包涵體的形式表達(dá),然而,我們是首次獲得VP110全長(zhǎng)表達(dá)。
【圖文】：

1 對(duì)蝦白斑綜合征病毒簡(jiǎn)介對(duì)蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，，WSSV)1992 年發(fā)現(xiàn)于臺(tái)灣，隨后在中國(guó)[1]、日本[2]、韓國(guó)[3]、泰國(guó)[3]、印度[4]、美國(guó)[5]、法國(guó)[6]等世界各國(guó)都有暴發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失如圖 1 所示[7]。

圖 2 有白色斑點(diǎn)的 WSSV 侵染的斑節(jié)對(duì)蝦的甲殼（a）和腹段最后部分（b）Fig. 2 White spot syndrome virus infected Penaeus monodon showing white spot symptoms oncarapace (a) and last abdominal segment (b)WSSV 是 Nimaviridae 科 Whispovirus 屬的唯一種[10, 11]，雙鏈 DNA 病毒，上傳的基因組序列有中國(guó)臺(tái)灣株(WSSV-TW)[12]、大陸株(WSSV-CN)[13]、泰國(guó)株(WSSV-TH)[14]和韓國(guó)株(WSSV-KR)[15]，基因組大小約 300 kb，是海洋病毒最大基因組之一。WSSV 病毒粒子外形像桿狀大約有 210-420nm，內(nèi)有 19nm 厚的核衣殼，外有 6-7nm 厚的囊膜包裹，病毒粒子的一端有類似尾的附著器[16, 17]。2 對(duì)蝦白斑綜合征病毒研究進(jìn)展2.1 對(duì)蝦白斑綜合征病毒環(huán)境控制研究進(jìn)展WSSV 的宿主主要是甲殼類動(dòng)物，宿主生活環(huán)境在無(wú)論是淡水還是海水，其
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S945.1

【共引文獻(xiàn)】

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1 陰曉麗;李卓佳;管淑玉;溫為庚;郭志勛;;番石榴葉水提取物抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒有效成分初探[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年13期

2 向峗;王剛;陳兆明;張銳;孫成波;;亞硝酸氮濃度變化對(duì)感染白斑綜合癥病毒的凡納濱對(duì)蝦的影響[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年30期

3 向峗;吳宇學(xué);王剛;陳兆明;張銳;孫成波;;不同溫度下哈維氏弧菌和白斑綜合癥病毒對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致病性[J];大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào);2015年01期

4 向峗;王剛;葉國(guó)鋒;陳兆明;楊世平;王成桂;孫成波;;鹽度變化對(duì)攜帶白斑綜合癥病毒(WSSV)的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的影響[J];海洋與湖沼;2014年02期

5 秦曉峰;蔣太交;程根宏;;抵御新發(fā)、突發(fā)病毒性傳染病的新思路——天然免疫機(jī)制的系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究和針對(duì)宿主的廣譜抗病毒藥物的研發(fā)[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2015年01期

6 向峗;王剛;龔永;陳兆明;張銳;孫成波;;氨氮質(zhì)量濃度對(duì)感染白斑綜合癥病毒的凡納濱對(duì)蝦的影響[J];熱帶生物學(xué)報(bào);2014年03期

7 向峗;王剛;陳兆明;張銳;孫成波;;不同溫度條件下鰻弧菌和白斑綜合癥病毒對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致病性[J];熱帶生物學(xué)報(bào);2015年01期

8 向峗;王剛;楊紹文;陳兆明;孫成波;;不同溫度條件下溶壁微球菌和白斑綜合癥病毒對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致病性[J];浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年04期

9 徐翊軒;戰(zhàn)文斌;邢婧;;溫度與脂多糖對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞吞噬活力的影響[J];中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2015年06期

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1 胡曉鵬;支原體小GTP結(jié)合蛋白類似片段（SGLP）與宿主細(xì)胞Rac1和Stat3相互作用及其功能影響[D];華中科技大學(xué);2013年

2 白楠;改性酵母葡聚糖的制備及其作為免疫增強(qiáng)劑在兩種甲殼動(dòng)物上的應(yīng)用[D];中國(guó)海洋大學(xué);2013年

3 胡曉鵬;支原體小GTP結(jié)合蛋白類似片段（SGLP）與宿主細(xì)胞Rac1和Stat3相互作用及其功能影響[D];華中科技大學(xué);2013年

4 黃海洪;凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）抗哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）感染的免疫應(yīng)答特征研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

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1 劉家舉;對(duì)蝦餌料生物攜帶WSSV的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及紅肉河藍(lán)蛤?qū)Ψ布{濱對(duì)蝦抗病力的影響[D];中國(guó)海洋大學(xué);2013年

2 黃建華;WSSV部分基因序列分析及防控WSS免疫增強(qiáng)劑的篩選[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 向峗;環(huán)境因子和弧菌對(duì)白斑綜合癥病毒（WSSV）在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)增殖的影響[D];廣東海洋大學(xué);2014年

4 徐翊軒;溫度和脂多糖對(duì)櫛孔扇貝（Chlamys farreri）血細(xì)胞免疫響應(yīng)的影響[D];中國(guó)海洋大學(xué);2014年

5 李文婷;常用消毒劑對(duì)白斑綜合癥病毒（WSSV）的作用及病毒在宿主的感染增殖[D];國(guó)家海洋局第三海洋研究所;2014年

本文編號(hào)：2626111