【摘要】：金錢魚(Scatophagus argus)為廣溫、廣鹽性魚類,廣泛分布于太平洋地區(qū)的海水中。因其環(huán)境耐受力強,已成為近年來在中國南部深受歡迎的優(yōu)質海水經濟魚類。為探究金錢魚MHC II類基因的結構與特性,本研究采用同源克隆和RACE等技術,在獲得金錢魚MHC IIα和β基因cDNA全序列的基礎上,分析其內含子序列、基因多態(tài)性和感染細菌前后的組織表達情況,為今后金錢魚抗病基因的篩選以及抗病育種提供依據。本研究的主要結果如下:1金錢魚MHC IIα基因結構、多態(tài)性及組織表達分析采用同源克隆和RACE等技術,獲得長度為1319 bp的金錢魚MHC IIα基因的cDNA全序列(Genebank號:KT005411),命名為Scar-DXA*01。分析發(fā)現(xiàn):金錢魚MHC IIα基因與其他硬骨魚類的結構域類似,由信號肽(SP)、兩個結構域(α1、α2)、連接肽、跨膜區(qū)及胞質區(qū)等結構域組成。它的ORF共編碼242個氨基酸,分子組成為C2145H3563N729O895S177,分子量59.56kDa;等電點為5.12。該基因包括4個外顯子和3個內含子,外顯子1編碼58bp的5`-UTR和73bp的信號肽,外顯子2編碼α1結構域,外顯子3編碼α2結構域,外顯子4編碼連接肽、跨膜區(qū)、胞質區(qū)以及537bp的3`-UTR。內含子1長度為246bp,它把外顯子1和外顯子2分開;內含子2緊跟著外顯子2,長度為590bp;內含子3長度為91bp。所有內含子與外顯子的匹配位點均為gt/ag。經Predict Protein預測,金錢魚MHC IIα基因蛋白質的主要功能位點如下:在α2區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個N-糖基化位點(NVSW),在α1、α2和CP/TM/CYT區(qū)共發(fā)現(xiàn)6個N-豆蔻�；稽c(GCSDSD、GVQVTE、GTSTNV、GVGPAV、GLGLTD和GVAAGT),在α2區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個蛋白激酶C-磷酸化位點(SFR、TSR、TVR),在α1和α2區(qū)共有4個酪氨酸激酶II-磷酸化位點(SQHE、SDSD、SFID和SRLE)。從43尾健康魚的209個陽性克隆中,獲得209條不同編碼的核苷酸序列,都包含完整的SP、α1和α2結構域,CP、TM及CYT,分別編碼163條不同的氨基酸序列。根據等位基因命名規(guī)則,可將它們歸為40個等位基因主型及94個等位基因亞型,分別命名為scar-dxa*0101~scar-dxa*4001(genbank號:kt176102~kt176141)。分析數(shù)據得知,金錢魚mhciiα基因的核苷酸序列中有143個變異位點,變異率達20.46%,其中簡約信息位點有112個;而氨基酸序列中有69個變異位點,變異率達29.61%,其中簡約信息位點有54個。另外,金錢魚mhciiβ基因的單倍型多樣度(hd)、平均核苷酸差異數(shù)目(k)和核苷酸多樣度(pi)分別為1.000、45.219和0.065。rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn),金錢魚mhciiα基因在所檢測的11種組織中均有表達,其中在皮、腸、脾、肌和鰓中的表達量較高,中等程度表達于胃、腦、心和腎等組織,而在肝和眼中的表達量較低。人工感染嗜水氣單胞菌后,mhciiα基因在不同實驗時間段內,于腸、皮、肝、腎、鰓、脾等組織中的表達量均發(fā)生不同程度的變化:腸、脾、皮、鰓和腎組織的表達量在不同時間點呈現(xiàn)波動情況,且均低于對照組;肝組織在24h~48h中的表達量低于對照組,但在12h、72h的表達量卻明顯高于對照組。2金錢魚mhciiβ基因結構、多態(tài)性及組織表達分析采用同源克隆和race等技術,獲得長度為1172bp的金錢魚mhciiβ基因的cdna全序列(genebank號:kt176142),命名為scar-dxb*01。分析表明:金錢魚mhciiβ基因與其他硬骨魚類的結構域類似,由信號肽(sp)、兩個結構域(β1、β2)、連接肽、跨膜區(qū)及胞質區(qū)等結構域組成。它的orf共編碼249個氨基酸,分子組成為c2239h3730n750o934s198,分子量62.45kda;等電點為5.09。該基因包括6個外顯子和5個內含子,外顯子1包括34bp的5`-utr和55bp的信號肽,外顯子2編碼β1結構域,外顯子3和4編碼β2結構域,外顯子5和6編碼連接肽、跨膜區(qū)、胞質區(qū)以及388bp的3`-utr。內含子1長度為216bp,它把外顯子1和外顯子2分開;內含子2緊跟著外顯子2,長度為1010bp;內含子3把β2結構域分開,長度為85bp;內含子4和5長度分別為258bp和94bp。所有內含子與外顯子的匹配位點均為gt/ag。經predictprotein預測,金錢魚mhciiβ基因蛋白質的主要功能位點如下:在β1區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個n-糖基化位點(nste),在β1、β2區(qū)和CP/TM/CYT區(qū)發(fā)現(xiàn)4個N-豆蔻�；稽c(GNFVGY、GLMYAE、GQEVTS、GLILGL),在β2區(qū)、CP/TM/CYT區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個蛋白激酶C-磷酸化位點(TPR、SLK、SER),在β2區(qū)和CP/TM/CYT區(qū)共有5個酪蛋白激酶II-磷酸化位點(SVFD、TSTD、SHLE、TDWD、SMPE),在β1區(qū)存在一個酪氨酸激酶磷酸化位點(KVEDVGY)。從43尾健康魚的209個陽性克隆中,獲得209條不同編碼的核苷酸序列,都包含完整的SP,β1和β2結構域,CP、TM及CYT,分別編碼179條不同的氨基酸序列。根據等位基因命名規(guī)則,可將它們歸為48個等位基因主型及96個等位基因亞型,分別命名為Scar-DXB*0101~Scar-DXB*4801(GenBank號:KT176142~KT176189)。分析得知,金錢魚MHC IIβ基因的核苷酸序列中有183個變異位點,變異率達25.74%,其中簡約信息位點有139個;而氨基酸序列中有83個變異位點,變異率達35.02%,其中簡約信息位點有62個。另外,金錢魚MHC IIβ基因的單倍型多樣度(HD)、平均核苷酸差異數(shù)目(K)和核苷酸多樣度(PI)分別為1.000、57.480和0.081。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),金錢魚MHC IIβ基因在所檢測的11種組織中均有表達,其中在脾、鰓、腸和皮膚中表達量較高,中等程度表達于腎、胃、心,而在眼、腦、肝、肌肉中表達量較低。對健康金錢魚人工感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后,發(fā)現(xiàn)其MHC IIβ基因在肝、脾、鰓、腎、皮和腸等組織中的表達量均發(fā)生了不同程度的變化:鰓、腸和脾組織的表達量,在12h~48h均低于對照組的表達量,但在72h的表達量卻明顯高于對照組;腎和皮組織的表達量在不同時間點呈現(xiàn)波動情況,且均低于對照組;肝組織在12h~24h中的表達量低于對照組,但在48h~72h的表達量卻明顯高于對照組。
【圖文】：

究概況物學特征tophagus argus)俗稱金鼓魚，是廣泛分布于太平洋地區(qū)性魚類[1-2]。它隸屬鱸形目(Perciformes)，鱸亞目(Percidae)，金錢魚屬(Scatophagus)。國際上，金錢魚科僅金，另外兩種分別為多帶金錢魚(Scatophagus multifascagus tetracanthus)[3]，，而生活在東南沿海的金錢魚是我[4]。，口小，近前位，兩領齒呈細剛毛刷狀且?guī)钆帕小Ｉw膜與峽部稍連。體高側扁，側面呈圓盤形，背部高黃褐色，體表滿布黑色圓斑似金錢狀，腹部銀白，尾、被小櫛鱗，側線完全。一般魚體長 10cm，成魚體長 16-18 枚，在臀鰭中有 13-15 枚；硬棘在背鰭中有 10腹鰭及背鰭的鰭棘中有毒腺，被蜇傷后蟄傷處通常會

圖 1-1 金錢魚 MHC II α基因的基因組序列(A)和示意圖(B)[57]（A）大寫字母表示外顯子，小寫字母表示內含子。數(shù)字表示該行末尾的核苷酸位點數(shù)；加粗數(shù)字表示該行末尾的氨基酸位點數(shù)；點虛線代表信號肽區(qū)域；下劃線代表蛋白激酶 C 磷酸化位點；橫虛線表示 N 糖基化位點，圓角框表示酪蛋白激酶 II 磷酸化位點；灰色方框表示N-豆蔻�；稽c；直角方框表示加尾信號和 PolyA 尾巴；陰影部分表示內含子與外顯子的匹配位點；橢圓表示起始和終止密碼子。（B）方框代表外顯子；橫線代表內含子；白色方框代表編碼區(qū)；黑色方框代表非編碼區(qū)，數(shù)字代表內含子或者外顯子的堿基長度。Fig.1-1 Genomic sequence (A) and schematic illustration (B) of theS. argus MHC II α gene.(A)Exons are shown in uppercase and introns are in lowercase letters. Numbers are representativeof the end of nucleotide sequence ( non-bold ) and deduced amino acid sequence (in bold);dot-dashed line stand for signal peptide; underline indicate Protein kinase C phosphorylation site;horizontal dotted line indicates N-glycosylation site ; rounded rectangle indicate Casein kinase IIphosphorylation site ; Grey box indicate N -nutmeg acetoxylation site site. Rectangular box arerepresentative of the polyadenylation signal and the polyA tail;dash area indicate introns and exonsmatching sites;ellipse indicate the start codon and stop codon.(B) Comparison of MHC IIα gene structures of the spotted scat and other species. Boxes stand for
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2625922