【摘要】：益生菌具有促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)及免疫力等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖。蝦醬是由蝦體及蝦體內(nèi)外微生物發(fā)酵而成,其中存在乳酸桿菌(Lactobacillus)、酵母菌(yeast)和芽孢桿菌(bacillus)等多種益生菌。目前,尚未見(jiàn)從蝦醬中篩選出益生菌應(yīng)用于斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖的報(bào)道。本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制作的蝦醬為材料,通過(guò)平板劃線分離法,從中分離具有強(qiáng)產(chǎn)酶能力和強(qiáng)拮抗能力的潛在益生菌,然后通過(guò)拌料投喂,研究篩選的益生菌對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的生長(zhǎng)、消化酶活性、非特異免疫力以及對(duì)水質(zhì)的影響。(1)本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制作的蝦醬為材料,通過(guò)分離純化、溶血活性、產(chǎn)酶活性和拮抗活性檢測(cè)從蝦醬中分離微生物,結(jié)果如下:從海南省定安城生產(chǎn)的幫輝海蝦調(diào)味醬蝦醬和�？谑斜镜禺a(chǎn)的蝦醬中,利用BCP培養(yǎng)基,從兩種蝦醬中共分離到產(chǎn)酸的菌株306株。通過(guò)溶血活性測(cè)定發(fā)現(xiàn),在306株產(chǎn)酸菌株中有36株為Y溶血,占總數(shù)的11.8%。測(cè)定上述36株菌的產(chǎn)酶活性,包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性,并測(cè)定其拮抗能力,病原菌為海水水產(chǎn)致病菌包括哈維氏弧菌(Vibrio Harveyi)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和淡水水產(chǎn)致病菌包括嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)及無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),選出的36株γ溶血的待選益生菌的淀粉酶和蛋白酶的活性比較高,其中A27、A35、B47為高產(chǎn)酶菌株,產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的活性與其他菌株具有顯著差異(P0.05) ; A20酶活和拮抗能力強(qiáng),其產(chǎn)淀粉酶的活性與其他菌株具有顯著差異(P0.05)且對(duì)4種致病菌的拮抗能力顯著高于其它菌株(P0.05) ; B3是強(qiáng)拮抗能力菌株,對(duì)實(shí)驗(yàn)所選的5種致病菌均有拮抗能力,且對(duì)其中的4種致病菌的拮抗能力顯著高于其它菌株(P0.05) ; A11、B15和B89具有酶活和拮抗能力,至少對(duì)1種致病菌的拮抗能力顯著高于其它菌株(P0.05)。通過(guò)16SrRNA分子鑒定此8株菌均為芽孢桿菌屬。(2)通過(guò)耐酸、耐膽鹽、耐人工胃腸液和粘附能力及藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)上述分離獲得8株芽孢桿菌進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn):芽孢桿菌A11、A20、A27、B47和B89的耐受能力強(qiáng),A20和A27在強(qiáng)酸作用60 min和120 min的遲滯時(shí)間(LT)都具有顯著性差異(P0.05);在膽鹽濃度為0.1%、0.3%和0.5%時(shí),A20的LT都具有顯著性差異(P0.05);當(dāng)人工胃液作用時(shí)間為3h時(shí),A20和A27與其他菌株具有顯著性差異(P 0.05);當(dāng)人工腸液作用時(shí)間為4 h時(shí),A27與其他菌株具有顯著性差異(P 0.05)。而在粘附性實(shí)驗(yàn)中,A20和A27各個(gè)時(shí)間段的自凝率都高,24h的自凝集率達(dá)到了 98%及以上,顯著高于其他菌株(P0.05),A20和A27對(duì)所選的5種水產(chǎn)致病菌的共凝集率均有顯著差異(P0.05),且共凝集率達(dá)70%以上;在抗生素的耐藥性實(shí)驗(yàn)中,A20和A27的敏感率是最高的。(3)將篩選出的芽孢桿菌A20和A27按照2.5 × 108CFU/g飼料的濃度拌料投喂斑節(jié)對(duì)蝦,檢測(cè)兩株芽孢桿菌對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦生長(zhǎng)、非特異免疫力和消化酶活性的影響,結(jié)果顯示飼養(yǎng)斑節(jié)對(duì)蝦6周后實(shí)驗(yàn)組A20和A27組優(yōu)于對(duì)照組,各項(xiàng)指標(biāo)如下:①斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的第2至6周,水體中化學(xué)需氧量(COD)、氨氮和亞硝酸鹽的濃度,投喂芽孢桿菌的A20組和A27組都顯著低于對(duì)照組(P0.05),且A27組與對(duì)照組有極顯著差異(P 0.01)�？傮w來(lái)說(shuō)水體中有害物質(zhì)的含量,實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組少,且A27組凈化水質(zhì)的作用最明顯;②生長(zhǎng)性能的測(cè)定中,實(shí)驗(yàn)組A20組和A27組的體長(zhǎng)、體重、肥滿(mǎn)度、增重率和特定生長(zhǎng)率都高于對(duì)照組,其中A20組的體重極顯著高于對(duì)照組(P 0.01)且增重率和特定生長(zhǎng)率顯著差高于對(duì)照組(P 0.05),A20組的生長(zhǎng)性能高于A27組;③非特異免疫指標(biāo)中,超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(POD),添加芽孢桿菌的A20組和A27組都顯著高于對(duì)照組(P 0.05),A20組和A27組的酸性磷酸酶(ACP)都極顯著高于對(duì)照組(P0.01),A20組的溶菌酶(LSZ)顯著高于對(duì)照組(P0.05),且A20組的非特異性指標(biāo)高于A27組;④消化酶活性的測(cè)定中,添加芽孢桿菌的A20組和A27組的胰蛋白酶及淀粉酶均極顯著高于對(duì)照組(P 0.01)。從蝦醬篩選出的γ溶血菌株,且產(chǎn)酸、酶活和拮抗能力強(qiáng),及具有耐受性、粘附性和對(duì)抗生素敏感的芽孢桿菌A20和A27,在一定程度上提高了實(shí)驗(yàn)斑節(jié)對(duì)蝦的消化酶活性和非特異免疫力,促進(jìn)斑節(jié)對(duì)蝦生長(zhǎng),并具有改善水質(zhì)的作用,芽孢桿菌A20在促進(jìn)斑節(jié)對(duì)蝦的生長(zhǎng)、非特異免疫力和消化酶活性方面較好;芽孢桿菌A27在改善水質(zhì)方面更具有優(yōu)勢(shì)。
【圖文】：

．圖２－１八株潛在益生菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ｅｉｇｈｔ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ逡逑１８逡逑

邐Ｂ１５邐Ｂ４７邐Ｂ８９逡逑菌株逡逑圖３－２八株芽孢桿菌在人工腸液的存活率，ａｂｅｄ表示每個(gè)時(shí)間段中存活率的顯著性水平逡逑（／＞＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｆｏｒ邋ｅｉｇｈｔ邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｓｐｐ．邋ｉｎ邋ｓｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｆｌｕｉｄ，，邋ａｂｅｄ邋ｉｓ逡逑ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｒａｔｅ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｔｉｍｅ邋ｐｅｒｉｏｄ邋（Ｐ＜邋０．０５）．逡逑３．邋３．邋３粘附性的測(cè)定逡逑（１）自凝集逡逑自凝集率見(jiàn)圖３－３，由圖可知Ａ２０和Ａ２７各個(gè)時(shí)間段的自凝集效果都比較好，逡逑２４邋ｈ的自凝集率達(dá)到了邋９８％及以上；Ａｌｌ在前４邋ｈ內(nèi)的自凝集率的增長(zhǎng)率最快，逡逑２４ｈ達(dá)到了邋９０％；邋Ａ３５、Ｂ３、Ｂ１５和Ｂ８９的自凝集率在２、４和２４ｈ時(shí)都一般，逡逑最后達(dá)到７０％左右
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S968.22

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本文編號(hào)：2612495