【摘要】：七彩神仙魚(yú)(Symphysodon haraldi)為原生于南美洲亞馬遜河流域的熱帶觀賞魚(yú),素有“熱帶魚(yú)之王”的美稱。盡管至今七彩神仙魚(yú)的養(yǎng)殖技術(shù)早已普及,但因?yàn)槠湓缙谛詣e區(qū)分困難,不易從外型上進(jìn)行雌雄辨別,該魚(yú)的繁殖依舊是通過(guò)自然配對(duì)、自然產(chǎn)卵的方式進(jìn)行的。這種人工模擬的繁殖方式,需要較久時(shí)間的配對(duì),拉長(zhǎng)了繁殖周期;再者,該魚(yú)產(chǎn)卵量少,且其人工催產(chǎn)技術(shù)也尚未能突破,這些因素都極大地制約苗種的生產(chǎn),限制了七彩神仙魚(yú)的規(guī)�；B(yǎng)殖。因此,為了促進(jìn)七彩神仙魚(yú)的人工繁殖和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,對(duì)七彩神仙魚(yú)的性腺分化時(shí)間、發(fā)育規(guī)律進(jìn)行深入研究非常有必要。掌握七彩神仙魚(yú)卵巢和精巢的相關(guān)生物信息將有助于我們研究雌雄辨別方法、加快人工催產(chǎn)的進(jìn)程,從而進(jìn)一步的控制七彩神仙魚(yú)繁殖的速度和質(zhì)量。本研究運(yùn)用下一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)七彩神仙魚(yú)性成熟時(shí)期的精巢和卵巢組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,經(jīng)過(guò)對(duì)高質(zhì)量序列重頭組裝、拼接和功能基因注釋,發(fā)掘了與性別決定、生殖細(xì)胞發(fā)育等重要生命進(jìn)程相關(guān)的候選基因,為后續(xù)功能基因的研究、篩選細(xì)胞分子標(biāo)記及早期性別分化提供重要參考;利用RACE技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗(yàn)證并克隆七彩神仙魚(yú)vasa的cDNA全長(zhǎng),用Q-PCR技術(shù)對(duì)vasa基因在七彩神仙魚(yú)胚胎各個(gè)時(shí)期和早期發(fā)育階段進(jìn)行了表達(dá)分析;根據(jù)獲得的vasa基因的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光探針,以此標(biāo)記PGCs,對(duì)七彩神仙魚(yú)仔魚(yú)階段的石蠟切片進(jìn)行原位雜交,定位PGCs并觀察其分化過(guò)程,確定其分化時(shí)間。主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.七彩神仙魚(yú)性腺轉(zhuǎn)錄組分析采用Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)4000完成七彩神仙魚(yú)成熟期精巢和卵巢組織1個(gè)混合樣的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。經(jīng)過(guò)對(duì)46,438,930條高質(zhì)量序列從頭組裝得到115,050個(gè)轉(zhuǎn)錄本和97,074個(gè)非冗余基因。將拼接得到的序列與Pfam、Swissprot和String等公共蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),Nr庫(kù)中比對(duì)到序列最多的物種是尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus);GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋了大量的功能基因并進(jìn)行了分類,提供了與性別決定、性腺分化、性激素調(diào)控等過(guò)程相關(guān)的候選基因,如vasa、sox9和foxl2;KEGG注釋結(jié)果提供了豐富的通路信息,如卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路。另外,從七彩神仙魚(yú)性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識(shí)別出26,083個(gè)SSR和10,571個(gè)SNP候選標(biāo)記,為分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了重要信息資源。2.七彩神仙魚(yú)vasa基因cDNA的克隆vasa基因是PGCs的第一個(gè)分子標(biāo)記,同時(shí)也是生殖細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記。本研究利用RACE技術(shù)得到七彩神仙魚(yú)vasa基因cDNA序列,全長(zhǎng)2,370bp,ORF編碼655個(gè)氨基酸,長(zhǎng)1,968bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙魚(yú)的vasa cDNA與尼羅羅非魚(yú)的同源性最高。半定量分析表明,vasa基因在成熟七彩神仙魚(yú)的性腺中特異表達(dá),在其他組織中無(wú)表達(dá)信號(hào)。Q-PCR結(jié)果顯示,vasa在七彩神仙魚(yú)早期胚胎發(fā)育階段及50日齡內(nèi)均有表達(dá)。在受精卵至囊胚期階段,vasa mRNA表達(dá)持續(xù)增加,在囊胚期至孵化期階段,表達(dá)持續(xù)降低。在仔魚(yú)階段,vasa分別在25日齡和40日齡出現(xiàn)了最低和最高表達(dá)量。繁殖前后比較發(fā)現(xiàn),繁殖前的精巢組織中vasa表達(dá)量比繁殖后的表達(dá)量低,而卵巢恰好相反。這些研究結(jié)果將為研究七彩神仙魚(yú)的原始生殖細(xì)胞定位、生殖細(xì)胞分子標(biāo)記及其性腺分化提供參考。3.七彩神仙魚(yú)早期性別分化本研究根據(jù)1-70日齡石蠟切片HE染色、熒光原位雜交結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室前期工作確定了七彩神仙魚(yú)性別分化時(shí)間。結(jié)果表明,七彩神仙魚(yú)雌魚(yú)分化時(shí)間約為30-40日齡;雄魚(yú)的分化時(shí)間約為50-70日齡;雌性比雄性分化早。另外,七彩神仙魚(yú)為雌雄異體分化類型,不存在雌雄同體或性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。確定其性別分化時(shí)間不僅能幫助研究魚(yú)類性別分化和調(diào)控機(jī)制,還可以為人工性別控制、單性育種提供參考,為人工催產(chǎn)和提高養(yǎng)殖效率給予理論支持。
【圖文】：

Table.1-1 The PGCs origin of different fishes起源 科 種名內(nèi)胚層 舌鰨科 半滑舌鰨[32]Cynogloss semilaevis鯉科 泰山螭霖魚(yú)[33]Varicorhinus macrolep胡子鯰科 革胡子鯰[34]Lepisosteus oculatus異溕科 青溕[35]Oryzias latipes雀鱔科 雀鱔[35]Lepisosteus oculatus中胚層 石鱸科 大斑石鱸[35]Pomadasys maculatus七鰓鰻科 普氏七鰓鰻[35]Lampetra japonica石首魚(yú)科 大黃魚(yú)[35]Larimichthys crocea黃多核體的表胚層 鯉科 紅眼魚(yú)[35]Scardinius erythrophthalmus中、內(nèi)胚層之下表胚層之上 棘臀魚(yú)科 大口黑鱸[36]Micropterus salmonides體細(xì)胞分化 鯉科 斑馬魚(yú)[37]Danio rerio

技術(shù)路線
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2611916