鈣離子作為第二信使,在植物生長發(fā)育及對環(huán)境響應(yīng)的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。不同的環(huán)境條件及生理狀態(tài)會引起植物體內(nèi)產(chǎn)生不同的鈣信號,而植物可以通過一系列鈣離子感受器及下游蛋白來實(shí)現(xiàn)對鈣信號的解碼。已有研究表明,CBL-CIPK介導(dǎo)的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了多種生物學(xué)過程,特別是對離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。然而由于CBL和CIPK家族成員在功能上的冗余,其眾多潛在的功能還有待進(jìn)一步發(fā)掘。糖作為植物最重要的代謝產(chǎn)物,其分配和利用受到嚴(yán)格的調(diào)控,但植物對糖穩(wěn)態(tài)的精細(xì)調(diào)控機(jī)制還不是很清楚。本研究在棉花中鑒定到GhCBL2-GhCIPK6參與了植物對糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控并對其機(jī)制進(jìn)行了解析,結(jié)果如下:1.陸地棉GhCIPK家族的鑒定及表達(dá)分析本研究通過將擬南芥中的At CIPK蛋白序列與棉花參考基因組TM-1數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,在棉花中共鑒定到79個GhCIPK成員并進(jìn)行進(jìn)化樹分析。絕大多數(shù)GhCIPK在A亞基因組和D亞基因組中均存在對應(yīng)的同源拷貝,其中A和D亞基因組中分別有4個成員屬于GhCIPK6亞家族,而GhCIPK6A3/D3在整個家族葉片表達(dá)分析中具有最高表達(dá)量,在本研究中用GhCIPK6表示。此外,GhCIPK6被...

【文章頁數(shù)】：137 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 鈣信號及其解碼
        1.1.1 鈣信號產(chǎn)生的基礎(chǔ)及特征
        1.1.2 鈣感受器與鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
    1.2 CBL-CIPK研究進(jìn)展
        1.2.1 CBL-CIPK的由來及互作基礎(chǔ)
        1.2.2 CBL-CIPK參與調(diào)控植物離子穩(wěn)態(tài)的研究
        1.2.3 CBL-CIPK參與的其它生物學(xué)功能
    1.3 植物中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)子研究進(jìn)展
        1.3.1 單糖轉(zhuǎn)運(yùn)子參與的植物糖轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.3.2 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)子參與的植物糖轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.3.3 SWEET轉(zhuǎn)運(yùn)子參與的植物糖轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.3.4 糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的調(diào)控
    1.4 本研究的目的與意義
2 材料方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 載體和菌株
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 植物材料培養(yǎng)條件
        2.2.2 基因家族進(jìn)化分析及其在葉片中的表達(dá)量分析
        2.2.3 載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.4 轉(zhuǎn)基因植株陽性檢測和拷貝數(shù)鑒定
        2.2.5 基因表達(dá)量檢測:RT-PCR,q RT-PCR和 Nothern雜交
        2.2.6 可溶性糖和淀粉含量測定
        2.2.7 磷酸化蛋白質(zhì)組分析
        2.2.8 轉(zhuǎn)錄組分析
        2.2.9 酵母雙雜交文庫構(gòu)建及篩選
        2.2.10 病毒誘導(dǎo)的基因沉默實(shí)驗(yàn)(VIGS)
        2.2.11 熒光素酶互補(bǔ)成像(LCI)分析
        2.2.12 亞細(xì)胞定位
        2.2.13 雙熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)
        2.2.14 蛋白原核表達(dá)和Pull-down實(shí)驗(yàn)
        2.2.15 離子組分析
        2.2.16 植物嫁接
        2.2.17 基因編輯檢測
        2.2.18 植物饑餓及葡萄糖脅迫處理
        2.2.19 缺素及不同營養(yǎng)水平處理
        2.2.20 蒸騰及離體失水分析
        2.2.21 水分利用效率分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 陸地棉GhCIPK家族蛋白鑒定及基因表達(dá)分析
        3.1.1 GhCIPK家族蛋白鑒定和進(jìn)化樹分析
        3.1.2 GhCIPK家族在葉片中的表達(dá)量及GhCIPK6 表達(dá)模式分析
    3.2 GhCIPK6 轉(zhuǎn)基因材料分子鑒定
        3.2.1 從多拷貝GhCIPK6 超表達(dá)棉花中分離單拷貝植株
        3.2.2 GhCIPK6 轉(zhuǎn)基因超表達(dá)及RNAi棉花分子鑒定
        3.2.3 GhCIPK6 敲除突變體陽性檢測及突變序列分析
        3.2.4 GhCIPK6 轉(zhuǎn)基因超表達(dá)擬南芥陽性檢測及表達(dá)量分析
    3.3 GhCIPK6 負(fù)調(diào)控植物生長發(fā)育
        3.3.1 GhCIPK6 轉(zhuǎn)基因棉花表型分析
        3.3.2 GhCIPK6 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析
    3.4 GhCIPK6 正調(diào)控植物可溶性糖積累
        3.4.1 GhCIPK6 轉(zhuǎn)基因棉花成株期葉片糖含量分析
        3.4.2 GhCIPK6 轉(zhuǎn)基因棉花不同組織可溶性糖含量分析
        3.4.3 GhCIPK6 促進(jìn)棉花糖分積累隨著植物的發(fā)育進(jìn)程而增加
        3.4.4 GhCIPK6 促進(jìn)棉花糖分積累依賴GhCIPK6 的表達(dá)量
        3.4.5 GhCIPK6 在促進(jìn)棉花糖分積累中與同源基因存在功能冗余
        3.4.6 GhCIPK6 調(diào)控糖分積累在不同物種中具有保守性
        3.4.7 GhCIPK6 不影響糖酵解路徑基因的表達(dá)
        3.4.8 GhCIPK6 削弱了可溶性糖的長距離運(yùn)輸
    3.5 GhCIPK6 正調(diào)控植株對饑餓及高濃度葡萄糖的耐性
    3.6 酵母雙雜交篩選GhCIPK6 互作靶標(biāo)蛋白
        3.6.1 酵母雙雜交文庫的構(gòu)建及GhCIPK6 互作蛋白篩選
        3.6.2 酵母雙雜交候選互作蛋白VIGS功能驗(yàn)證
        3.6.3 GhCBL家族分析及GhCIPK6-GhCBL點(diǎn)對點(diǎn)酵母雙雜交篩選
        3.6.4 VIGS對候選GhCBL進(jìn)行功能驗(yàn)證
    3.7 GhCBL2 參與了GhCIPK6 介導(dǎo)的可溶性糖積累
        3.7.1 GhCBL2與GhCIPK6 體外互作
        3.7.2 GhCBL2與GhCIPK6 體內(nèi)互作并招募GhCIPK6 到液泡膜
        3.7.3 GhCBL2超表達(dá)棉花陽性檢測及表達(dá)量分析
        3.7.4 GhCBL2敲除突變體序列分析
        3.7.5 GhCBL2正調(diào)控棉花可溶性糖積累
        3.7.6 GhCBL2 突變削弱了GhCIPK6 介導(dǎo)的葡萄糖積累
    3.8 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)篩選GhCIPK6 潛在下游靶標(biāo)
        3.8.1 差異磷酸化蛋白分析
        3.8.2 磷酸化候選蛋白VIGS功能驗(yàn)證
    3.9 Gh TST2 參與了GhCIPK6 介導(dǎo)的可溶性糖積累
        3.9.1 GhTST家族分析
        3.9.2 Gh TST2與GhCIPK6 酵母雙雜交及Pull-down分析
        3.9.3 Gh TST2與GhCIPK6 Bi FC體內(nèi)互作實(shí)驗(yàn)
        3.9.4 棉花GhTST2超表達(dá)植株陽性檢測及表達(dá)量分析
        3.9.5 棉花GhTST2敲除突變體突變序列分析及表達(dá)量檢測
        3.9.6 擬南芥AtTST1/2敲除突變體創(chuàng)建及突變序列分析
        3.9.7 GhTST2正調(diào)控棉花可溶性糖含量
        3.9.8 Gh TST2 突變削弱了GhCIPK6 介導(dǎo)的棉花可溶性糖積累
        3.9.9 At TST1/2 突變阻斷了GhCIPK6 在擬南芥中介導(dǎo)的可溶性糖積累
    3.10 GhCIPK6 的其他生物學(xué)功能
        3.10.1 GhCIPK6 負(fù)調(diào)控植株礦質(zhì)營養(yǎng)的含量
        3.10.2 超表達(dá)GhCIPK6 加速離體條件下葉片失水速率
        3.10.3 超表達(dá)GhCIPK6 降低植株蒸騰作用并提高水分利用效率
        3.10.4 礦質(zhì)元素與植物可溶性糖含量及蒸騰的關(guān)系
        3.10.5 GhCIPK6 參與對糖含量和水分利用的調(diào)控是獨(dú)立的
        3.10.6 GhCIPK6 轉(zhuǎn)基因材料轉(zhuǎn)錄組分析
4 討論
    4.1 GhCIPK6 參與調(diào)節(jié)植物糖穩(wěn)態(tài)
    4.2 GhCIPK6 調(diào)控糖穩(wěn)態(tài)的路徑存在功能冗余
    4.3 糖在植物生長發(fā)育和逆境抗性中的作用
    4.4 CIPK6功能多樣性
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表的論文
致謝



本文編號：4020106