為了開發(fā)高靈敏度、高特異性且易于普及的玉米轉(zhuǎn)抗草丁膦抗性Bialaphos resistance(Bar)基因的鑒定方法,采用核酸序列依賴性擴(kuò)增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification,NASBA)技術(shù),根據(jù)轉(zhuǎn)基因成分Bar基因的mRNA序列,設(shè)計(jì)合成Bar基因的檢測(cè)特異引物和探針,通過優(yōu)化NASBA擴(kuò)增反應(yīng)程序和產(chǎn)物檢測(cè)體系,開發(fā)不依賴核酸擴(kuò)增儀的轉(zhuǎn)基因成分Bar的分子檢測(cè)試劑盒,短時(shí)間內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分Bar進(jìn)行高靈敏度篩查。結(jié)果表明,檢測(cè)特異性好且靈敏度高,其靈敏度可達(dá)6 fg,樣本檢測(cè)也說明試劑盒具有較高靈敏度和特異性,且適合基層部門和采樣現(xiàn)場(chǎng)對(duì)Bar轉(zhuǎn)基因成分的早期鑒定。

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圖1 Bar-NASBA試劑盒對(duì)Bar的檢測(cè)特異性

為探索檢測(cè)體系的最低檢出限,實(shí)驗(yàn)將原濃度為600ng·μL-1轉(zhuǎn)Bar基因的玉米的RNA做連續(xù)的梯度稀釋,濃度梯度范圍見表1:從1×10-1ng·μL-1至1×10-8ng·μL-1。對(duì)稀釋后的RNA樣品進(jìn)行NASBA反應(yīng),NASBA反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果證明,模板濃度稀釋至10....

圖2 Bar-NASBA試劑盒的檢測(cè)靈敏性

電泳結(jié)果也表明,檢測(cè)濃度可達(dá)到1×10-8ng·μL-1,濃度為1×10-9ng·μL-1時(shí)顯示為陰性(結(jié)果未給出),由此可見,該反應(yīng)體系具有較高的靈敏性可達(dá)fg級(jí)別,且陰性對(duì)照無擴(kuò)增信號(hào)(圖2)。3.3Bar-NASBA檢測(cè)試劑盒樣本檢測(cè)結(jié)果

圖3 Bar-NASBA試劑盒的樣本檢測(cè)

采用Bar-NASBA試劑盒分別對(duì)普通玉米與轉(zhuǎn)Bar玉米取莖葉片、玉米莖和玉米根總RNA檢測(cè),結(jié)果:轉(zhuǎn)Bar基因玉米相關(guān)樣品均顯陽性,表明試劑盒應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bar基因的玉米各組織檢測(cè)具有較高靈敏度和特異性(圖3)。3.4Bar-NASBA檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性和保存期結(jié)果

本文編號(hào)：4012645