煙草(Nicotiana tabacum L.)是我國重要的經(jīng)濟作物之一,但我國煙草育種面臨親本匱乏、品種遺傳背景狹窄、盲目性、重復性大等問題。SNP標記被廣泛應用于作物種質資源的親緣關系鑒定、遺傳圖譜構建、分子標記輔助選擇等方面。高通量轉錄組測序為SNP標記的開發(fā)提供了大量信息,但在煙草中的應用鮮有報道。因此,本研究基于煙草轉錄組測序獲得的大量unigenes,利用生物信息學方法鑒定出大量SNPs,進而根據(jù)SNP位點信息開發(fā)AS-PCR和KASP標記,并應用于煙草種質遺傳多樣性分析和種質的指紋圖譜構建。具體研究結果如下:1.采用高通量Illumina HiSeqTM對10個煙草材料進行轉錄組測序,共獲得108.04G Clean bases,平均每個樣本10.084G。將reads比對到參考基因組上進行SNP calling,共獲得SNP位點121416個。其中,轉換型SNP有78236個,占比64.4%,顛換型SNP有42842,占比35.3%,二者之比為1.83:1。轉換型中,C->T略多,而G->T在顛換型中占多數(shù)。2.采用AS-PCR、ARMS-PCR和KASP三...

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 DNA分子標記技術的種類及其特點
        1.1.1 第一代DNA分子標記
            1.1.1.1 限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)
            1.1.1.2 隨機擴增DNA多態(tài)性(RAPD)
            1.1.1.3 擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)
        1.1.2 第二代DNA分子標記
            1.1.2.1 簡單重復序列(SSR)標記
            1.1.2.2 簡單重復序列區(qū)間(ISSR)標記
        1.1.3 第三代DNA分子標記
    1.2 SNP的發(fā)掘技術
        1.2.1 基于公共數(shù)據(jù)庫中的EST序列開發(fā)SNP
        1.2.2 基于基因組序列開發(fā)SNP
        1.2.3 基于第二代高通量測序技術開發(fā)SNP
        1.2.4 基于Genotyping-by-sequencing(GBS)開發(fā)SNP
    1.3 SNP的檢測方法及原理
        1.3.1 基于凝膠電泳的檢測方法
            1.3.1.1 單鏈構象多態(tài)性(SSCP)
            1.3.1.2 酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)
            1.3.1.3 等位基因特異性PCR(AS-PCR)
        1.3.2 基于高通量、自動化的檢測方法
            1.3.2.1 直接測序
            1.3.2.2 基因芯片
            1.3.2.3 變性高效液相色譜(DHPLC)
            1.3.2.4 質譜檢測
            1.3.2.5 高分辨熔解曲線(HRM)
            1.3.2.6 KASP技術
    1.4 SNP標記在作物遺傳育種中的應用
        1.4.1 高密度遺傳圖譜的構建
        1.4.2 重要性狀的基因定位
        1.4.3 品種鑒定及種質資源管理
    1.5 煙草DNA分子標記研究現(xiàn)狀
    1.6 本研究的目的及意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 設備與儀器
    2.2 方法
        2.2.1 煙草轉錄組測序
        2.2.2 SNP位點篩選
        2.2.3 SNP引物設計
            2.2.3.1 等位基因特異性PCR(AS-PCR)引物
            2.2.3.2 四引物擴增受阻突變體系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)引物
            2.2.3.3 競爭性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)引物
        2.2.4 DNA提取及檢測
        2.2.5 AS-PCR擴增條件的優(yōu)化
        2.2.6 SNP檢測方法的選擇
        2.2.7 SNP擴增產(chǎn)物的基因分型
        2.2.8 煙草種質的遺傳多樣性分析
        2.2.9 DNA指紋圖譜構建
3 結果與分析
    3.1 基于轉錄組測序的SNP分析
    3.2 DNA濃度、純度及質量檢測
    3.3 AS-PCR擴增條件的優(yōu)化
        3.3.1 退火溫度的優(yōu)化
        3.3.2 反應體系的優(yōu)化
        3.3.3 反應程序的優(yōu)化
    3.4 煙草SNP標記檢測方法的選擇
        3.4.1 AS-PCR、Tetra-primer ARMS-PCR和 KASP對位點S350 的檢測效果
        3.4.2 AS-PCR、Tetra-primer ARMS-PCR和 KASP對位點S382 的檢測效果
    3.5 多態(tài)性SNP引物篩選
    3.6 SNP擴增產(chǎn)物的基因分型
        3.6.1 AS-PCR檢測方法的SNP分型
        3.6.2 KASP檢測方法的SNP分型
    3.7 SNP位點序列的功能分析
    3.8 94份煙草材料的SNP遺傳多樣性分析
        3.8.1 SNP標記的多態(tài)性分析
        3.8.2 94份煙草材料的聚類分析
        3.8.3 DNA指紋圖譜的構建
4 討論與結論
    4.1 討論
        4.1.1 PCR體系對擴增產(chǎn)物的影響
        4.1.2 引物3’端不同錯配方式對PCR擴增產(chǎn)物的影響
        4.1.3 SNP標記檢測方法的選擇
        4.1.4 基于轉錄組開發(fā)SNP標記
        4.1.5 SNP標記的遺傳多樣性分析
        4.1.6 SNP指紋圖譜構建
        4.1.7 SNP與生物學性狀的關系
    4.2 結論
參考文獻
致謝
附錄 Ⅰ:46對AS-PCR引物序列信息
附錄 Ⅱ:11組KASP多態(tài)性引物序列信息
附錄 Ⅲ:16組多態(tài)性SNP引物



本文編號：3824031