發(fā)布時間：2022-01-09 01:33

　　玉米（Zea mays L.）作為我國重要的糧食作物之一,在我國的農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)中起著重要作用。玉米螟等害蟲嚴(yán)重危害玉米生產(chǎn),每年導(dǎo)致約10%的玉米產(chǎn)量損失�？瓜x轉(zhuǎn)基因玉米的廣泛應(yīng)用可以有效防治玉米蟲害,降低玉米產(chǎn)量損失,并減少農(nóng)藥使用量。研發(fā)有應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因玉米事件,需要明確外源基因在受體基因組中的整合位點(diǎn),而且外源基因的整合不能對玉米生產(chǎn)性狀產(chǎn)生不利影響。本研究所用的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米IE034由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制,前期研究表明該轉(zhuǎn)化事件的外源基因有一個拷貝,并且室內(nèi)和田間均高抗玉米螟。但是,在研究過程中發(fā)現(xiàn)此轉(zhuǎn)基因玉米事件出現(xiàn)籽粒敗育的現(xiàn)象。本文首先運(yùn)用TAIL-PCR分離抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米IE034的側(cè)翼序列,通過構(gòu)建Fosmid基因組文庫和遺傳定位的方法對外源基因的整合位點(diǎn)進(jìn)行了研究,并對該轉(zhuǎn)基因玉米出現(xiàn)的籽粒敗育表型進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:1、通過TAIL-PCR分離出IE034中外源基因插入位置上游旁側(cè)序列,發(fā)現(xiàn)外源基因插入到了玉米基因組的重復(fù)序列區(qū),并且外源基因在插入玉米基因組中的過程中進(jìn)行了復(fù)雜的整合,部分骨架載體整合到玉米基因組中。2、提取轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA,構(gòu)建F... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

996年～2016年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積(James,2016)

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言序列 (Liu et al, 1995a)。TAIL-PCR 是利用幾個嵌套的已知序列的特異性引物依次與退火溫度較低的簡并引物 (Arbitrary Degenerate Primer，AD Primer) 組合。特異性的引物的退火溫度較高，一般在 60℃左右；簡并引物的退火溫度較低，在 45℃左右。然后依據(jù)引物的差異設(shè)計(jì)不對稱的溫度循環(huán)，再經(jīng)過巢式反應(yīng)特異性的引物優(yōu)先進(jìn)行擴(kuò)增，得到特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。TAIL-PCR 反應(yīng)步驟如圖 1.2 所示：第一次 PCR 反應(yīng)包括 5 次高特異性反應(yīng)、1 次低特異性反應(yīng)、10 次較低特異性的反應(yīng)和 12 次熱不對稱的的超級循環(huán)。然后將第一次反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板以特異引物 SP2 和同一簡并引物進(jìn)行熱不對稱超級循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇性的擴(kuò)增。第三次反應(yīng)是將第二次反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，以 SP3 和同一引物 AD 作為引物進(jìn)行普通的擴(kuò)增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳分離出已知序列鄰近的目標(biāo)序列。

學(xué)院碩士學(xué)位論文 進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的擴(kuò)增成功率高于 90%，大部分情況下獲得的IL-PCR 還被應(yīng)用于分離 T-DNA 插入構(gòu)建的突變體庫的側(cè)翼序列。R分離T-DNA插入突變體的側(cè)翼序列鑒定出潛在參與纖維素酶和半 年 Fujimoto 等通過 TAIL-PCR 的方法對 T-DNA 進(jìn)行定位來研究染向 PCR 技術(shù)man 等 (1988) 提出依據(jù)常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 技術(shù)，通過列的方法。其原理是用已知序列選擇合適的限制性內(nèi)切酶消化轉(zhuǎn)化進(jìn)行自身環(huán)化后作為模板，在已知序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)過列 (圖 1.3)。反向 PCR 技術(shù)成功克隆出側(cè)翼序列后 (Triglia et al.,19

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]棉花單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記研究進(jìn)展[J]. 王振玉,李威,周曉箭,裴小雨,劉艷改,周克海,張文生,孟清芹,王海風(fēng),葛勇,李瑩,劉俊芳,馬雄風(fēng),楊代剛.  棉花學(xué)報(bào). 2016(04)
[2]Fosmid library construction and screening for the maize mutant gene Vestigial glume 1[J]. Chaoxian Liu,Xiaoli Liu,Lei Lei,Haiying Guan,Yilin Cai.  The Crop Journal. 2016(01)
[3]玉米基因組Fosmid文庫構(gòu)建及類受體激酶基因（Psy1和Psy2）篩選[J]. 吳曉軍,徐麗,王守才.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2014(10)
[4]轉(zhuǎn)基因水稻EB7001S事件特異性檢測方法的建立[J]. 魏歲軍,鄧力華,肖國櫻.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2014(05)
[5]植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 駱翔,劉志頤,章樹民,申碩,王德福,王勁松.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2014(15)
[6]一個玉米旱敏感突變體的遺傳分析與基因定位[J]. 牟穎熙,劉艷,王國英,鄭軍.  植物遺傳資源學(xué)報(bào). 2014(03)
[7]Panhandle PCR strategy to amplify the upstream unknown sequence of the Pr1 gene of pythium guiyangense[J]. DUAN Siliang,SU Xiaoqing,YU Sheng.  Journal of Medical Colleges of PLA. 2013(05)
[8]圖位克隆技術(shù)在玉米基因分離中的應(yīng)用[J]. 呂洪坤,鄭軍.  分子植物育種. 2013(03)
[9]轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米環(huán)境安全性及我國應(yīng)用前景[J]. 李寧,何康來,崔蕾,王振營.  植物保護(hù). 2011(06)
[10]擴(kuò)增T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的方法及其應(yīng)用進(jìn)展[J]. 祁洋,李燕,王永智,尉亞輝.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2009(17)



本文編號：3577676