藜麥（Chenopodium quinoa.Wild）是鹽生植物,因其獨(dú)特的生物學(xué)特性及全面的營養(yǎng)價值逐漸成為越來越多生物學(xué)家的研究對象。隨著藜麥全基因組序列信息的解析,越來越多藜麥功能基因逐漸被克隆,但用于藜麥的CRISPR/Cas9基因組編輯體系還未見報道,這一定程度上限制了藜麥的基因功能研究。乙酰-5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶（Acetylserotonin methyltransferase,ASMT）是褪黑素生物合成的最后一種酶,在植物褪黑激素的產(chǎn)生中起著限速作用,編碼ASMT蛋白的基因通常以多基因家族的形式存在,近年來越來越多研究表明,提高ASMT基因的表達(dá)水平可以提高植物對逆境抗性,但ASMT基因突變后的表型及生理影響還不清楚。為此,本研究開展了三部分的工作,首先對藜麥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)的條件進(jìn)行了摸索確定,為篩選構(gòu)建藜麥CRISPR/Cas9系統(tǒng)所需的U6啟動子奠定基礎(chǔ);其次,對藜麥不同U6啟動子進(jìn)行克隆,構(gòu)建表達(dá)載體篩選高轉(zhuǎn)錄活性的藜麥U6啟動子;最后對藜麥ASMT基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析,確定了ASMT靶標(biāo)基因,并利用篩選得到的U6啟動子構(gòu)建藜麥ASMT基因的CRISPR/Cas... 

【文章來源】：煙臺大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

煙臺大學(xué)碩士學(xué)位論文13圖2高等植物褪黑素的合成和代謝途徑（王蕊等2016）Figure2Biosynthesisandmetabolismpathwayofmelatonininhigherplant3.3植物中褪黑素合成基因ASMT的研究進(jìn)展褪黑素生物合成的最后一步由ASMT催化,該酶和動物褪黑素合成途徑中HIOMT高度同源。Kang等首次在水稻中克隆了ASMT,序列分析表明該酶屬于O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族,其中18個編碼OMT的cDNA與小麥COMT高度同源，將這些cDNA與大腸桿菌重組并進(jìn)行表達(dá),發(fā)現(xiàn)只有AK072740基因具有合成褪黑素的能力,進(jìn)一步研究表明衰老和外源脅迫因素可以誘導(dǎo)ASMT的表達(dá)[93]。在煙草中異源過量表達(dá)AANAT和HIOMT基因可以提高煙草褪黑素含量，并一定程度緩解UVB對DNA造成的損傷[94]。Park等首次在大腸桿菌中純化了水稻OsASMT并進(jìn)行了酶動力學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)黑暗環(huán)境下褪黑素含量顯著高于光照,并且這種上調(diào)與OsASMT的表達(dá)相一致，這表明植物中ASMT基因的表達(dá)可能與動物中類似，受到光周期或晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)[95]。隨后對水稻ASMT基因家族的ASMT1(AK072740)、ASMT2(AK069308)及ASMT3(AAL34945)進(jìn)行的功能分析表明,這3個基因的表達(dá)均受ABA和MeJA的誘導(dǎo),但是這些ASMT的催化活性處于較低水平,因此不適宜通過調(diào)控這些酶的表達(dá)或外源轉(zhuǎn)入相關(guān)基因來提高植物褪黑素含量[96]。Zuo等克隆了編碼蘋果ASMT的基

第一章藜麥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系的建立20量才能達(dá)到合適水平。本實(shí)驗(yàn)比較了0.4-0.8M甘露醇作為穩(wěn)滲劑制備原生質(zhì)體的效果，結(jié)果（圖2-1圖2-2）表明：低甘露醇濃度下（0.4M-0.5M）,原生質(zhì)體的產(chǎn)量較低，存活率也處于較低水平，部分細(xì)胞在洗滌過程中因吸水而漲破；當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到0.6M時，原生質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)外滲透壓趨于平衡，原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到峰值，活性最高，原生質(zhì)體形態(tài)飽滿，葉綠體分布均勻，洗滌過程中只有少量破損；當(dāng)甘露醇濃度繼續(xù)增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性均開始下降，部分細(xì)胞因失水而皺縮。綜上，0.6M甘露醇作為藜麥原生質(zhì)體制備過程中的穩(wěn)滲劑最佳。圖2-1不同甘露醇濃度下原生質(zhì)體產(chǎn)率和存活率Figure2-1Theyieldandviabilityofprotoplastawithdifferentmannitolconcentrations注：酶成分為1.5%纖維素酶+0.3%離析酶，酶解時間為8h圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±SD圖2-2不同甘露醇濃度下原生質(zhì)體形態(tài)Figure2-2Themorphologyofprotoplastswithdifferentmannitolconcentrations

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas植物基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 劉耀光,李構(gòu)思,張雅玲,陳樂天.  華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2019(05)
[2]番茄U6啟動子的克隆及CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立[J]. 蒲艷,劉超,李繼洋,阿爾祖古麗·塔什,胡燕,劉曉東.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2018(02)
[3]Rapid generation of genetic diversity by multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in rice[J]. Lan Shen,Yufeng Hua,Yaping Fu,Jian Li,Qing Liu,Xiaozhen Jiao,Gaowei Xin,Junjie Wang,Xingchun Wang,Changjie Yan,Kejian Wang.  Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[4]高等植物褪黑素的合成和代謝研究進(jìn)展[J]. 王蕊,楊小龍,須暉,李天來.  植物生理學(xué)報. 2016(05)
[5]棉花不同GbU6啟動子截短克隆及功能鑒定[J]. 雷建峰,李月,徐新霞,阿爾祖古麗·塔什,蒲艷,張巨松,劉曉東.  作物學(xué)報. 2016(05)
[6]植物CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)與突變分析[J]. 馬興亮,劉耀光.  遺傳. 2016(02)
[7]木本植物原生質(zhì)體培養(yǎng)體系研究進(jìn)展[J]. 彭邵鋒,陸佳,陳永忠,王瑞,陳隆升,馬力,王湘南.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2013(01)
[8]植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其在生產(chǎn)上的應(yīng)用[J]. 劉永立,林穎.  新農(nóng)村. 2011(06)
[9]荔枝轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞再生松散性胚性愈傷組織的原生質(zhì)體分離與初步培養(yǎng)[J]. 賴呈純,賴鐘雄,黃淺,桑慶亮.  亞熱帶農(nóng)業(yè)研究. 2007(02)
[10]刺葡萄原生質(zhì)體分離研究[J]. 呂長平,石雪暉,徐艷,葉云.  湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2005(04)

博士論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點(diǎn)編輯研究[D]. 朱金潔.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]基于CRISPR/Cas9的擬南芥多基因編輯及其在基因功能研究中的應(yīng)用[D]. 劉玟杉.重慶大學(xué) 2015

碩士論文
[1]百合原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)的研究[D]. 柳玉晶.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



本文編號：3265755