根據(jù)已報(bào)道的在大麥糊粉層特異表達(dá)的α-淀粉酶基因Amy32B,利用序列合成技術(shù)將Amy32B啟動子與紅色熒光蛋白基因RFP融合在一起,構(gòu)建植物表達(dá)載體,并由農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入水稻品種明恢86中,對轉(zhuǎn)基因水稻植株中的紅色熒光蛋白RFP活性進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,Amy32B啟動子在水稻中同樣具有活性,在糊粉層背部特異表達(dá),在整個(gè)植株中也有微弱本底表達(dá)。這表明Amy32B啟動子為外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻糊粉層中高表達(dá)提供了新的工具,也為研究基因工程改良水稻提供了新的參考。 

【文章來源】：雜交水稻. 2020,35(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

表達(dá)載體pCAMBIA3301-pAmy32B的核心序列

分別從10個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因植株和對照組中各隨機(jī)挑選3個(gè)單株，取其蠟熟期的根、莖、葉片、枝梗和種子在熒光體視顯微鏡下進(jìn)行觀察。在所取的3個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因單株的種子糊粉層背側(cè)觀察到紅色熒光信號，而在陰性對照組中均沒有紅色熒光信號，同時(shí)在陽性轉(zhuǎn)基因單株的根、莖、葉片和枝梗中也檢測到了微弱的熒光信號，如圖4、圖5所示。3 討論

Amy32B基因由Whittier等[10]克隆鑒定，它編碼1個(gè)低PI同工酶，在赤霉素和脫落酸的控制下在大麥糊粉層細(xì)胞中表達(dá)，Amy32B啟動子全長1.4 kb，含有核心啟動子元件TATA-box以及受赤霉素調(diào)控的GARE和脫落酸調(diào)控的ABRE。為探究Amy32B啟動子在水稻中的表達(dá)情況，本研究選取Amy32B基因翻譯起始位點(diǎn)ATG前長度為688 bp的序列作為Amy32B啟動子驅(qū)動紅色熒光蛋白RFP，在轉(zhuǎn)基因水稻植株中檢測到了紅色熒光信號，說明實(shí)驗(yàn)所選取的Amy32B啟動子具有轉(zhuǎn)錄活性。在進(jìn)行啟動子活性分析的研究時(shí)通常選用報(bào)告基因來檢測，報(bào)告基因可實(shí)時(shí)定量檢測細(xì)胞活動和生理化學(xué)物質(zhì)的變化情況，目前常用的報(bào)告基因主要有熒光素酶基因luc[15]和β-葡萄糖苷酶基因gus[16]2類，其中檢測熒光素酶基因表達(dá)時(shí)需要向材料內(nèi)滲入熒光素，而對β-葡萄糖苷酶基因組織化學(xué)檢測時(shí)，則需要反應(yīng)底物4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸X-Gluc參與，該反應(yīng)底物價(jià)格昂貴，并且這2種檢測方法對植物材料都有破壞性。本實(shí)驗(yàn)選取的是克隆于珊瑚中的紅色熒光蛋白RFP，其相對分子量小，熒光穩(wěn)定，不需要外源底物或輔助因子的報(bào)告基因，可直接通過熒光顯微鏡來檢測其活性，十分簡單快速。圖4 Amy32B陽性轉(zhuǎn)基因水稻種子紅色熒光信號檢測

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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