百脈根(Lotus corniculatus)作為優(yōu)良豆科牧草有很大的利用前景,但干旱限制了其推廣利用效率。研究植物在干旱脅迫下基因的差異表達是尋找抗旱基因和培育抗旱品種的重要手段。抑制消減雜交是篩選差異表達基因的一種有效方法。為培育高抗旱性百脈根種質(zhì),本課題組經(jīng)過多年研究篩選出高抗旱性百脈根種質(zhì)B08,為了解B08百脈根種質(zhì)抗旱機理、培育高抗旱性百脈根、挖掘相關(guān)抗旱基因、推廣利用B08百脈根,本研究以B08百脈根葉片為材料,采用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建干旱脅迫下B08百脈根正反抑制消減文庫,從正反文庫中各隨機挑選600個陽性克隆測序分析,篩選到了B08百脈根抗旱相關(guān)基因,再通過對這些基因所調(diào)控的抗旱相關(guān)植物激素、滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)、葉綠素、抗氧化酶活性進行測定,得到以下結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了B08百脈根種質(zhì)SSH c DNA文庫。(2)正反文庫各得到574條、595條高質(zhì)量序列,正庫序列平均長度為207.5 bp,反庫序列平均長度為242.7 bp。使用Phred對測序得到的1 169條高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)進行組裝,最終得到632條Unigene序列(又稱獨立基因),其中正向文庫178條,反向文庫454條。(3)用得到的632條Unigene分別與NCBI nt、NCBI nr、Swissport等數(shù)據(jù)庫進行Blast比對,有147條基因注釋成功,另外還發(fā)現(xiàn)了485條新基因。所得到的632條Unigene序列比對結(jié)果顯示,這些基因大部分與百脈根基因組DNA1-6號染色體上的基因同源。(4)對NCBI nr注釋結(jié)果進行物種統(tǒng)計,結(jié)果顯示與毛果楊、蘋果、菠菜、大麥、油菜等同源性較高。對正反庫注釋信息進行物種統(tǒng)計,這些基因中參與細胞及細胞器構(gòu)成、結(jié)合活性、細胞代謝過程、催化作用的比例較大。(5)得到的Unigene涉及植物激素合成、能量代謝、光合作用、蛋白質(zhì)代謝、離子轉(zhuǎn)運、核酸代謝、信號轉(zhuǎn)導等。(6)發(fā)現(xiàn)了與植物抗旱密切相關(guān)的吲哚-3-乙酸誘導蛋白ARG7(Indole-3-acetic acid-induced protein ARG7)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Serine/Threonine-protein phosphatase)、類鈣調(diào)素蛋白(Calmodulin-like protein,CML)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)等。(7)ARG7基因差異表達的干旱處理組百脈根葉片脯氨酸、可溶性糖含量顯著高于對照組(P0.05)。干旱第3 d、5 d、7 d各處理脯氨酸含量分別增加了7.9倍、8.1倍、8.4倍,增強了百脈根抗旱性。(8)類鈣調(diào)素蛋白基因差異表達的干旱處理組百脈根葉片過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性顯著提高(P0.05)。干旱第3 d、5 d、7 d各處理過氧化氫酶活性分別增加了4.1倍、1.9倍、4.0倍,過氧化物酶活性分別增加了3.7倍、5.4倍、4.6倍,超氧化物歧化酶活性分別增加了3.5倍、1.8倍、2.9倍,有利于清除百脈根葉片細胞中的活性氧,提高抗旱性。(9)干旱處理下,百脈根葉片葉綠素a葉綠素b,總?cè)~綠素含量顯著降低,第5d開始無顯著變化。類鈣調(diào)素蛋白基因差異表達的干旱處理組百脈根葉片中葉綠素a/b的值顯著高于對照組。(10)絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶、ARG7基因差異表達的處理組百脈根葉片IAA、ABA含量顯著增加(P0.05)。干旱第3 d、5 d、7 d各處理IAA含量分別增加了1.5倍、1.2倍、1.3倍,ABA含量分別增加了46.14%、53.34%、46.45%,增強了百脈根對干旱環(huán)境的適應(yīng)性。
【學位單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S541.6
【部分圖文】：

圖 2.1 土壤相對含水量隨時間變化Fig. 2.1 variation of soil relative water content with time2.3.2 葉片相對含水量隨干旱時間的變化通過對干旱第 1 d、第 3 d、第 5 d、第 7 d、第 9 d 及對照組（CK）對含水量的測定分析可知，隨著干旱時間的增加，葉片相對含水量逐漸下1 d 至第 5 d 葉片相對含水量下降緩慢，第 5 d 之后急劇下降，表明葉片水系統(tǒng)已崩潰。其中第 3 d 葉片相對含水量為 84.63 %，在 80 %-90 %范圍內(nèi)輕度干旱標準；第 5 d 葉片相對含水量為 77.82 %，在 65 %-80 %范圍內(nèi)，度干旱標準；第 7 d 葉片相對含水量為 53.79 %，在 50 %-65 %范圍內(nèi)，符干旱標準；第 9 d 時，葉片相對含水量僅為 38.28 %，接近永久枯死狀態(tài)（

圖 2.2 葉片相對含水量隨時間變化Fig. 2.2 Variation of leaves relative water content with time2.3.3 植物形態(tài)隨干旱時間變化根據(jù)圖 2.3 可知，干旱脅迫處理及未干旱處理的 CK 對照組百脈根植如表 2.1：表 2.1 百脈根植物形態(tài)隨干旱時間變化情況Table2.1 Lotus corniculatus of changes in plant morphology with drought time處理Treatment植物的形態(tài)The morphology of plants干旱程度Degree of drouCK 鮮嫩，長勢良好 無干旱3 d 輕微萎蔫 輕度干旱5 d 萎蔫卷曲，但夜間能夠恢復 中度干旱7 d 萎蔫卷曲，夜間不能恢復 重度干旱

圖 2.3 干旱處理 3 d、5 d、7 d 及對照組百脈根形態(tài)Fig. 2.3 Plant morphology of Lotus corniculatus on the 3rd, 5th, and 7th day of drought treatment2.4 討論干旱是一個全球性的問題，目前氣溫升高的形式下全球各地區(qū)干旱形式越來越嚴峻，研究和提高植物對干旱的適應(yīng)能力，是一個需要長期持續(xù)的工作。干旱對植物的脅迫主要是對植物根的脅迫和對葉的脅迫，因此，在干旱試驗中確定干旱脅迫程度必須結(jié)合根脅迫和葉脅迫狀態(tài)來確定。學術(shù)界公認的根脅迫的參考指標為土壤相對含水量，但植物受到干旱脅迫后通常葉的水分變化最明顯，結(jié)合葉片相對含水量和葉的形態(tài)變化可以更有效確定植物所受干旱脅迫程度，因此，使用葉片相對含水量和葉片形態(tài)變化作為干旱程度界定輔助指標已越來越普遍，而這種方式也更為合理地反應(yīng)了植物地上部分和地下部分所受的脅迫程度，對植物所受脅迫狀態(tài)的解釋更為合理。干旱脅迫下百脈根 SSH 文庫構(gòu)建的目的是為了

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本文編號：2829035