【摘要】：朱砂根(Ardisia crenata Sims)是集觀賞、藥用價值于一身的具有多種生態(tài)及經(jīng)濟用途的優(yōu)良植物資源,在生態(tài)城市建設(shè)中具有廣闊的應(yīng)用前景,其主要活性成分三萜皂苷(Triterpenoid saponin)有助于心血管疾病和癌癥的防治。本研究首先建立朱砂根愈傷組織培養(yǎng)體系,接著以朱砂根愈傷組織為研究材料、以酵母提取物(Yeast extract,YE)、黑曲霉(Aspergillus niger)、殼聚糖(Chitosan)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)、稀土元素鑭(La)、鈷離子(Co~(2+))等6種誘導子為研究對象進行誘導子的篩選工作,確立促進朱砂根愈傷組織三萜皂苷合成的最佳誘導子以及最佳誘導子組合,最后進一步分析誘導子對朱砂根愈傷組織在代謝層面的影響,為探討誘導子調(diào)控三萜皂苷合成的作用機制奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果不但為朱砂根次生代謝產(chǎn)物三萜皂苷的工廠化生產(chǎn)提供科學依據(jù)和技術(shù)支撐,而且對于朱砂根種質(zhì)資源的保存及生態(tài)環(huán)境的保護也具有重大的理論和實踐意義。主要研究結(jié)果如下:(1)在比較根、莖、葉3種類型外植體對朱砂根愈傷組織的影響時發(fā)現(xiàn),以莖段為外植體時誘導率最高,而且愈傷組織的增殖量顯著高于以根和葉為外植體誘導出的愈傷組織。但是,以莖為外植體誘導出的愈傷組織的三萜皂苷含量低于以根為外植體的愈傷組織。由此可見,以莖段為外植體有利于愈傷組織的生長,以根為外植體有利于三萜皂苷的合成。綜合考慮三萜皂苷產(chǎn)量,以莖段為外植體誘導愈傷組織為最優(yōu)處理。(2)在供試濃度中,3種生物誘導子(YE、黑曲霉、殼聚糖)對愈傷組織的生長具有不同的生理作用,YE、黑曲霉顯著促進生長,殼聚糖抑制生長;而3種生物誘導子對三萜皂苷合成均表現(xiàn)出顯著的促進作用,其中以黑曲霉的促進作用最強。同時,在對黑曲霉添加濃度進行篩選時,發(fā)現(xiàn)各濃度黑曲霉均能提高朱砂根愈傷組織中三萜皂苷的含量,其中50 mg/L為最佳誘導濃度。但是,黑曲霉促進愈傷組織生長的最佳誘導濃度為100 mg/L。因此,綜合考慮三萜皂苷產(chǎn)量,100 mg/L黑曲霉最有利三萜皂苷的生產(chǎn)。(3)在供試濃度中,3種非生物誘導子(MeJA、La、Co~(2+))均有利于朱砂根愈傷組織的生長以及三萜皂苷的合成,其中以La最能促進三萜皂苷的合成。同時,通過對La添加濃度的篩選,發(fā)現(xiàn)各濃度下的La均有利于愈傷組織的生長以及三萜皂苷的合成,其中最佳誘導濃度為30μmol/L。(4)通過將不同濃度La和黑曲霉進行組合的正交試驗,可以發(fā)現(xiàn)各組合都能促進朱砂根愈傷組織三萜皂苷合成。其中,將100 mg/L黑曲霉和30μmol/L La進行組合的誘導效果最好,均高于單獨添加100 mg/L黑曲霉和30μmol/L La。(5)2種誘導子黑曲霉和La以及黑曲霉+La組合可以顯著激活朱砂根愈傷組織抗氧化防御系統(tǒng)和三萜皂苷合成途徑,促進三萜皂苷的合成。但誘導效果存在差異性,黑曲霉+La組合誘導效果優(yōu)于2種誘導子單獨使用(黑曲霉、La)。利用2種誘導子之間的協(xié)同作用,更大程度提高抗氧化酶(SOD、POD、CAT)、三萜皂苷合成關(guān)鍵酶(β-AS)的活性和增加三萜皂苷的積累量。黑曲霉、La作為外源誘導子通過信號傳遞到細胞內(nèi),迅速刺激朱砂根愈傷組織的氧化應(yīng)激防御系統(tǒng),三萜皂苷合成途徑被活化,促進三萜皂苷的合成與積累。
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S567.19
【圖文】：

圖 1-1 三萜皂苷合成途徑Fig. 1-1 Triterpenoid saponins synthesis pathway2.3.1 起始階段在生物體內(nèi)被稱為“活性異戊二烯”的物質(zhì) IPP 和 DMAPP，是萜類化合物和植物甾醇在生物體內(nèi)合成的真正前體[50]。甲羥戊酸（MVA）和甲基赤蘚糖醇磷酸化（MEP）2 條獨立途徑均可形成 IPP 和 DMAPP[76]�，F(xiàn)有研究表明，MVA和 MEP 途徑分別存在于植物體的不同部位：MVA 途徑主要存在于細胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與甾醇、倍半萜和三萜等次生代謝產(chǎn)物的生物合成[77]；MEP 途徑主要存在于線粒體/高爾基體以及質(zhì)體中，參與二萜、單萜、類胡蘿卜素、異戊二烯等的生物合成[77]。此外，MVA 途徑和 MEP 途徑并不是相互獨立的，他們可以通過質(zhì)體膜交換一些常見的中間代謝產(chǎn)物[78]。MVA 途徑是學術(shù)界公認的三萜皂苷生物合成途徑[79]。這一途徑中不可逆的限速反應(yīng)是 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶 A（HMG-CoA）經(jīng) HMG-CoA 還原酶（HMGR）還原形成甲羥戊酸[73]。HMGR

中數(shù)值為平均值±標準誤；同列不同小寫字母表示在 0.05 水平差異顯著，下同。ata in picture are means±SE. Different lowercase letters mean significant differences at 0.05evel. The same as below.圖 2-1 不同外植體對三萜皂苷含量的影響Fig. 2-1 Effect of different explants on Triterpenoid saponins content

于新環(huán)境適應(yīng)期，生命活動受到抑制。10-25d 為指數(shù)生長期，愈傷組織細胞適應(yīng)環(huán)境開始分裂，數(shù)目迅速增加，鮮重急劇增加，從第 10d 的 2.554g 增 6.2472g，增長了 144.60%。25d 后，愈傷組織增殖緩慢，進入穩(wěn)定期。過了期之后，愈傷組織將會進入衰退期。因此，我們選擇處于愈傷組織指數(shù)生長的 25d 作為朱砂根愈傷組織的繼代周期。

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