【摘要】：鋁毒害是影響酸性土壤上作物產量的主要因素,傳統(tǒng)的施加石灰的方法并不能經濟有效的緩解土壤鋁毒害,通過選育耐鋁品種或改良現(xiàn)有品種的耐鋁性,使之適應酸土環(huán)境,是提高酸性土壤上作物產量的有效途徑。青藏高原一年生野生大麥具有豐富的遺傳多樣性,擁有許多優(yōu)異的抗(耐)性相關基因,是國際大麥界所矚目的珍貴野生資源,從西藏野生大麥中發(fā)掘優(yōu)良基因,進而應用于栽培大麥或其他作物,對作物品種改良具有重要意義。本研究以課題組擁有的耐鋁西藏野生大麥基因型XZ16和鋁敏感野生大麥基因型XZ61為材料,以國際公認的耐鋁栽培大麥基因型Dayton為對照,利用MIFE(Microelectrode Ion Flux Estimation)技術研究了大麥耐酸性和耐鋁性的離子機制及其差異;本課題組前期利用基因芯片技術比較分析了 XZ16、XZ61和Dayton響應鋁脅迫的基因表達差異,本研究分離克隆了兩個在XZ16中特異響應鋁脅迫的基因HvABCB25和HvEXPA1,并利用BSMV-VIGS(Barley stripe mosaic virus induced gene silencing)沉默和同源過表達技術,探討了這兩個基因調控野生大麥耐鋁性的機制。主要研究結果如下:1.酸、鋁脅迫對西藏野生大麥根尖離子流影響的基因型差異以耐鋁性差異顯著的西藏野生大麥基因型XZ16(耐鋁)和XZ61(鋁敏感)以及耐鋁栽培大麥基因型Dayton為材料,利用MIFE技術檢測了三個基因型酸和鋁脅迫下根尖伸長區(qū)和成熟區(qū)根際pH以及H+K+、Ca2+離子流的變化。結果表明,酸脅迫和鋁脅迫導致的離子流的變化主要發(fā)生在根尖伸長區(qū),鋁脅迫能夠明顯抑制根尖H+的內吸和K+的外排,且對鋁敏感基因型XZ61的抑制作用更強;鋁脅迫還導致根尖Ca2+顯著外排,而在酸脅迫下,Ca2+離子流幾乎沒有變化,此外,ATP酶的活性在酸脅迫下顯著增強而在鋁脅迫下顯著降低。這些結果表明,XZ16的耐酸性主要與其較強的H+內吸能力以及較強的根際堿化能力有關,而大麥耐酸性和耐鋁性機制的差異可能是由于鋁脅迫導致的Ca2+的外排和對ATP酶活性的抑制造成的。2.西藏野生大麥耐鋁相關基因HvABCB25的克隆與功能鑒定以XZ16、XZ61和Dayton為材料,比較了野生大麥和栽培大麥HvAACT1基因上游的插入序列,結果發(fā)現(xiàn)野生大麥的HvAACT1基因上游沒有1-kb和MRL插入且HvAACT1的表達水平顯著低于栽培大麥。從之前基因芯片的結果中篩選到一個XZ16耐鋁相關的新的ABC家族基因HvABCB25,利用BSMV-VIGS沉默及同源過表達的方法對該基因的功能進行了驗證,HvABCB25蛋白序列分析表明,該蛋白包含5個跨膜域和一個AAA功能域,進化分析表明該蛋白的3D結構和AAA功能域從藻類到被子植物的進化過程中一直非常保守,表達特征分析結果表明該基因僅受鋁脅迫的誘導,且該誘導僅發(fā)生在根尖部位,這恰恰是鋁脅迫的主要作用位點。亞細胞定位的結果表明HvABCB25定位于液泡膜上。利用BSMV-VIGS沉默HvABCB25后,植株的耐鋁性顯著降低,同時該基因的沉默顯著增加了鋁在細胞質中的積累;相反,HvABCB25的同源過表達顯著提高了親本的耐鋁性并且降低了鋁在細胞質中的積累,但是對細胞液中總的鋁含量沒有顯著的影響。這些結果表明,HvABCB25是液泡膜上的鋁轉運蛋白,主要功能是將細胞質中的鋁轉運到液泡中進行區(qū)室化隔離解毒,這屬于大麥的內部解毒機制,這一新基因的發(fā)現(xiàn)同時也為大麥耐鋁性的研究提供了新的方向。3.西藏野生大麥HvEXPA1基因的克隆與功能分析以耐鋁的野生大麥基因型XZ16為材料,利用BSMV-VIGS沉默技術對一個在三個基因型間差異表達的expansin家族基因HvEXPA1的功能進行初步探討,結果表明,對照條件下,該基因在地上部和地下部均有表達,而鋁脅迫對該基因的誘導僅發(fā)生在根尖部位,且該基因僅受鋁脅迫的誘導,對其他三價金屬(如Cr、La)以及pH均沒有響應。亞細胞定位結果表明,HvEXPA1定位于細胞膜上,生物信息學分析表明,HvEXPA1攜帶3個結構域,且EXPA1蛋白的3D結構從藻類到被子植物的進化過程中一直十分保守。沉默HvEXPA1顯著抑制了對照和鋁脅迫條件下根系的伸長、降低了根尖細胞的長度以及根系的干重,然而,該基因沉默對鋁脅迫下根系的相對伸長率卻沒有顯著的影響;此外,沉默HvEXPA1顯著降低了根尖的鋁含量,且降低的鋁含量主要來自于細胞壁而不是細胞液。這些結果表明,HvEXPA1是一個能被鋁誘導的expansin家族基因,它主要參與根尖伸長區(qū)細胞正常的伸長過程并且它可能通過調節(jié)細胞壁松散過程中暴露出來的鋁結合位點的數(shù)量來影響細胞壁的鋁含量。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S512.3
【圖文】：

圖１－１植物對錯脅迫的綜合反應（Ｓｉｎｇｈ等，２０１７）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｔｏｗａｒｄｓ邋ａｌｕｍｉｎｉｕｍ邋ｓｔｒｅｓｓ邋（Ｓｉｉｉｇｈ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１７）．逡逑在過去的幾十年里，科研工作者們一直致力于研究鋁毒害為什么能如此快速的抑制根系的伸長，他們的研究結果表明，鋁毒害會導致細胞周期失調，減少有絲分裂間期裂期的細胞活動，從而導致根系伸長對紹脅迫的快速響應（Ｓａｎｊｉｂ邋Ｋｕｍａｒ等，２００９；邋Ｓｉｌｖ，２０１２），這種機制在多種作物中都被證實，例如小麥（７ｈ＿ｈｃｗ／ｎ邋ａｅｓｆｔ＇ｖＨＷ）邋（Ｌｉ等，逡逑

外部解毒機制主要包括有機酸的分泌，例如檸檬酸、蘋果酸和草酸，這些有逡逑機酸能夠在根際螯合鋁，降低根際有效鋁的濃度，從而達到解毒的目的，這類機逡逑制也是目前被研究的最透徹的一種機制（圖１－２）邋（Ｍａ等，２００１邋），Ｍｉｙａｓａｋａ逡逑等（１９９１）的研究表明，招脅迫卜，耐招的苜莆（尸／ｍｓｅｏ／ＭＶＨ／ｇｆｌｒ／ｓ）基因型根逡逑系檸檬酸的分泌量要顯著高于鋁敏感基因型。Ｄｅｌｈａｉｚｅ等（邋１９９３）通過研宄耐鋁逡逑性不同的小麥近等基因系發(fā)現(xiàn)耐鋁基因型的蘋果酸分泌量比鋁敏感基因型要高５逡逑到１０倍，Ｒｙａｎ等（１９９５）通過對大量耐錯性不同的小麥基因型的研究進一步證逡逑實，鋁脅迫誘導的蘋果酸分泌是小麥耐鋁性的主要原因；Ｍａ等（邋１９９７）還發(fā)現(xiàn)，逡逑鋁脅迫會誘導決明子（ＣＭｄａｆｏｍＬ．）的檸檬酸分泌，且耐鋁基因型的分泌量更逡逑高；此外，Ｆｕｅｎｔｅ等（邋１９９７）通過將銅綠假單胞菌的檸檬酸合酶基因轉入煙草和逡逑木瓜中來對其進行遺傳改造，結果在顯著增加其檸檬酸的分泌的同時，植株的耐逡逑鋁性也顯著增強，這些結果均表明，有機酸的分泌與植物的耐鋁性息息相關。逡逑ＡＩ－ａｃｉｉｖａｌｃｄｃｍ0ｘ邋ｏｆ邋ｏｒｇａｎｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｐａｌｌｉ邋ｆｏｌｌｏｗｅｄ逡逑

細胞的內部，因此，除了外部解毒機制之外，植物仍需要一些內部的解毒機制來應對這些逡逑進入到細胞內的鋁，這一機制主要包括在細胞質中螯合鋁（Ｍａ等，２００１）以及將鋁轉運逡逑到液泡中進行區(qū)室化隔離解毒（Ｌｅｉ等，２０１７）（圖１－２），Ｌａｒｓｅｎ等（２００７）在擬南芥上逡逑發(fā)現(xiàn)了一個液泡膜上的ＡＢＣ轉運蛋白基因，該基因的主要作用是將細胞質中的鋁逡逑轉運到液泡中進行區(qū)室化解毒；Ｘｉａ等（２０１０）在水稻上發(fā)現(xiàn)了一個質膜上的ｉＶｒａ／／基因，逡逑該基因主要負責鋁向細胞內的轉運，敲除該基因會顯著降低植株對鋁的吸收，從而增強植逡逑株耐鋁性；此外，Ｈｕａｎｇ等（２０１２）在水稻上也發(fā)現(xiàn)了與基因功能類似的基因ＯｄＬＷ，逡逑該基因雖然表達模式與基因不同，但是功能也是負責將鋁轉運到液泡中進行區(qū)室逡逑化解毒。最近發(fā)現(xiàn)的蕎麥ＦｅＷＧ／基因功能也與之類似，該基因主要在根尖的皮層中表逡逑達，并且該基因的表達特異性地受鋁脅迫的誘導，亞細胞定位結果表明該基因定位在液泡逡逑膜上

【參考文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 蔡圣冠;西藏野生大麥鋁毒耐性機理研究[D];浙江大學;2013年

2 戴華鑫;青藏高原一年生野生大麥耐鋁毒機制的研究[D];浙江大學;2013年

本文編號：2791484