【摘要】：甘草具有補脾益氣,清熱解毒,祛痰止咳,緩急止痛等功效,甘草酸是甘草的主要活性成分,甘草酸的含量是《中國藥典》列入的衡量甘草藥材品質(zhì)優(yōu)劣的主要指標。甘草酸藥用價值與工業(yè)價值顯著,不僅運用于臨床治療,還廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、保健品等行業(yè)。目前,僅靠種植甘草無法滿足其巨大市場需求,同時,種植甘草周期長,品質(zhì)優(yōu)劣不一,過渡采挖甘草造成土地沙化、土壤貧瘠、生態(tài)環(huán)境破壞等嚴重問題,因此,采用新興科學(xué)技術(shù)獲得甘草酸已成為甘草資源研究的熱點問題。近年來,隨著合成生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,人們對于甘草酸生物合成途徑的研究日趨成熟,因此,運用合成生物學(xué)技術(shù)人工合成甘草酸有望成為緩解甘草酸市場供不應(yīng)求,改善甘草種質(zhì)資源的重要方法。目前,甘草酸生物合成途徑中的關(guān)鍵基因多數(shù)已被成功表征,甘草酸的生物合成通路已基本打通,科學(xué)家已在酵母中合成了甘草酸的前體——甘草次酸。然而,甘草酸中下游途徑中的UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs)與細胞色素P450還原酶(GuCPR)仍未被成功解析。甘草酸糖基轉(zhuǎn)移酶需在UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs)催化作用下,方可催化甘草次酸生成終產(chǎn)物甘草酸;甘草酸細胞色素P450還原酶(GuCPR)為細胞色素P450的催化過程提供電子,是細胞色素P450超家族酶中的重要成員,因此,解析甘草酸UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs)與甘草酸細胞色素P450還原酶(GuCPR)對甘草酸的生物全合成至關(guān)重要。因此,本文研究內(nèi)容及主要研究成果如下:1.通過本課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫與NCBI上報道的同源基因比對,篩選出了3條候選甘草酸UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs),命名為GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3;篩選出了1條甘草酸細胞色素P450還原酶(命名為GuCPR)全長編碼序列,并以cDNA為模板,基于PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù),通過特異性引物擴增,克隆了GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3與GuCPR的完整編碼區(qū)(CDS),得到了3條1000bp左右和1條2000bp左右的條帶,并通過連接pEASY-Blunt載體得到GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3與GuCPR的克隆重組質(zhì)粒�；诘鞍捉Y(jié)構(gòu)預(yù)測與系統(tǒng)進化樹分析,顯示GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3歸屬于UDP-葡萄糖脫氫酶超家族,GuCPR歸屬于細胞色素P450還原酶超家族。此外,利用相關(guān)生物信息學(xué)分析方法分析了GuGDHs與GuCPR的基本特性。2.通過同源重組方法構(gòu)建了GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3的pET-30a(+)原核表達載體,并在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中異源表達。通過IPTG(異丙基硫代半乳糖苷,Isopropy1 β-D-Thiogalactoside)誘導(dǎo)表達,獲得GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3重組蛋白。3.通過酶促反應(yīng)催化實驗,檢測NADPH在340nm處吸光度的增加來確定甘草酸UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs)的活性,證明了GuGDH1、GuGDH2具有活性,而GuGDH3不具有活性。本文研究成果可為下一步解析甘草酸生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.71
【圖文】：

圖１－１甘草三萜類化合物逡逑ａ．甘草酸ｂ．甘草次酸逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄ邋ｏｆ邋Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ邋ｕｒａｌｅｎｓｉｓ逡逑ａ．邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂ．邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．２黃酮類成分逡逑甘草黃酮同樣有抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、抗氧化等顯著的藥理活性。近年逡逑來，甘草黃酮的抗ＨＩＶ病毒作用多見報道。以甘草總黃酮測定經(jīng)大鼠小腸吸收逡逑前后ＨＩＶ病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和ＨＩＶ病毒整合酶的活性，結(jié)果表明甘草總黃酮經(jīng)大鼠逡逑小腸吸收后的供試液不具有抗ＨＩＶ病毒活性，進而表明甘草總黃酮的抗ＨＩＶ病逡逑毒作用Ｍ。此外，研宄表明，甘草葉中富含的甘草總黃酮可以誘導(dǎo)單核巨噬細胞逡逑

析蛋白的結(jié)構(gòu)．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍＬ邋？ｔｏｐｉｃ＝進行蛋白亞細胞定位預(yù)測。ｒｇ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／）進行蛋白質(zhì)三級比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。逡逑取逡逑如下圖所示，１８Ｓ和２８Ｓ兩條較高，可用于下一步實驗。逡逑

的ＲＮＡ質(zhì)量較好，完整性較高，可用于下一步實驗。逡逑ｒ逡逑圖３－１甘草總ＲＮＡ提取結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋Ｌｉｃｏｒｉｃｅ逡逑３１逡逑

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1 柴勇;;維生素B12生物合成基因的克隆技術(shù)[J];生物技術(shù)通報;1987年06期

2 王力;;頭孢菌素C產(chǎn)生菌頂頭孢霉菌的環(huán)化酶和擴環(huán)酶的活力水平[J];國外藥學(xué)(抗生素分冊);1987年04期

3 Halina Lis ,Nathan Sharon ,苗青;糖蛋白凝集素的碳水化合物單位[J];長沙水電師院(自然科學(xué)學(xué)報);1988年04期

4 明乾良;韓婷;黃芳;秦路平;;人參皂苷生物合成途徑及其相關(guān)酶的研究進展[J];中草藥;2010年11期

5 薛永常,李金花,盧孟柱,張綺紋;木質(zhì)素單體生物合成途徑及其修訂[J];林業(yè)科學(xué);2003年06期

6 黃新,黃璐琦,邱德有;紫杉醇生物合成途徑中相關(guān)酶的研究進展[J];中國生物工程雜志;2002年05期

7 林懋怡;�；�;劉晉杰;柳威;劉忠;;基于轉(zhuǎn)錄組分析華細辛甲基丁香酚生物合成途徑的相關(guān)基因[J];中草藥;2017年15期

8 陳穎;孫海燕;曹銀萍;;三萜皂苷生物合成途徑研究進展[J];中國野生植物資源;2012年06期

9 徐定邦;;有機酸生物合成途徑[J];江蘇食品與發(fā)酵;1985年01期

10 許曉雙;張福生;秦雪梅;;三萜皂苷生物合成途徑及關(guān)鍵酶的研究進展[J];世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化;2014年11期

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本文編號：2772042