【摘要】：苦蕎具Kelch基序的F-box(KFB)蛋白是E3泛素連接酶家族成員SCF(Skp1-Cullin-F-box)復(fù)合物的組分之一,其通過(guò)特異性識(shí)別靶蛋白使其泛素化降解,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)。研究報(bào)道KFB蛋白通過(guò)控制次生代謝相關(guān)酶的穩(wěn)定性影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,以實(shí)現(xiàn)對(duì)次生代謝途徑的調(diào)控。本研究對(duì)本課題組苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的15種苦蕎KFB基因(命名為FtKFB1、FtKFB 2、FtKFB 3、FtKFB 4、FtKFB 5、FtKFB 6、FtKFB 7、FtKFB 8、FtKFB 9、FtKFB 10、FtKFB11、FtKFB 12、FtKFB 13、FtKFB 14、FtKFB15)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析苦蕎中KFB基因的組織特異性表達(dá)。將Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的兩種具有次生代謝調(diào)控功能的擬南芥KFB蛋白(At1g80440、At2g44130)與FtKFB1-FtKFB15的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),因FtKFB7、FtKFB14分別與At1g80440、At2g44130具有44%和41%的一致性,推測(cè)FtKFB7、FtKFB14可能與次生代謝調(diào)控有關(guān)。通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)及GST pull-down實(shí)驗(yàn)對(duì)FtKFB7、FtKFB14與苦蕎苯丙氨酸解氨酶(FtPAL)及苦蕎蘆丁降解酶(FtRDE)之間的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建植物表達(dá)載體,在煙草中實(shí)現(xiàn)FtKFB7和FtKFB14基因的過(guò)表達(dá),檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的總黃酮含量,以進(jìn)一步探究FtKFB蛋白在次生代謝途徑中的調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果表明:(1)對(duì)苦蕎不同組織(根、莖、葉、花、種子)中FtKFB1-FtKFB15的qRT-PCR分析表明FtKFB4、5、6、7、8、9、10、11在葉中表達(dá)量最高,分別為根中表達(dá)量的10.0、7.1、21.3、7.7、13.4、18.4、1.5、2.4倍;FtKFB2、3、13、14的表達(dá)量在種子中最高,分別為根中的1.3、8.5、7.0、10.1倍;FtKFB12在莖中有著最高的表達(dá)水平,約為根的2.1倍;FtKFB1在根中表達(dá)量最高,而FtKFB15在莖和根中的表達(dá)水平接近。表明在苦蕎各組織中不同F(xiàn)tKFB基因存在表達(dá)差異。(2)分別構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-FtKFB7、pGBKT7-FtKFB14和獵物載體pGADT7-FtPALB、pGADT7-FtPALN、pGADT7-FtRDE,共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞,以pGBKT7-Lam+pGADT7-T作為陰性對(duì)照,pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)驗(yàn)證該酵母雙雜交系統(tǒng)無(wú)自激活效應(yīng)。X-α-Gal顯色結(jié)果表明FtKFB7與FtRDE、FtPALN、FtPALB之間都存在相互作用,而FtKFB14只與FtPALB之間有相互作用。通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了FtKFB與FtPAL、FtRDE之間的相互作用,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。(3)構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6p-1-FtKFB7、pGEX-6p-1-FtKFB14,經(jīng)GST親和層析純化得到FtKFB7、FtKFB14蛋白;通過(guò)鈷離子螯合柱層析成功純化得到PALB蛋白;從苦蕎籽粒中純化得到FtRDE酶粗提液。GST pull-down實(shí)驗(yàn)及Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明在pull-down洗脫液中成功檢測(cè)到FtKFB7與FtPALB或FtRDE蛋白,進(jìn)一步證實(shí)了FtKFB與FtPAL、FtRDE在體外的相互作用。(4)為了進(jìn)一步研究FtKFB蛋白在植物次生代謝中的功能,構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-eGFP-FtKFB7和pCAMBIA3301-eGFP-FtKFB14,通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草品種SR-1(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR-1)以實(shí)現(xiàn)FtKFB7、FtKFB14在煙草中的過(guò)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Basta抗性篩選及PCR檢測(cè)得到FtKFB7、FtKFB14、pCAMBIA3301-eGFP的T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,并初步測(cè)定了T0代pCAMBIA3301-eGFP和FtKFB14轉(zhuǎn)基因植株中的總黃酮含量,結(jié)果表明FtKFB14的過(guò)表達(dá)可能對(duì)黃酮含量起負(fù)調(diào)節(jié)作用,但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。該實(shí)驗(yàn)為深入了解苦蕎KFB蛋白對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的影響創(chuàng)造了條件。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S517

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本文編號(hào)：2771897