【摘要】：植物中的類鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基蛋白CBL(Calcineurin B-like protein)家族成員與其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting kinase protein)家族成員形成了復(fù)雜精細(xì)的CBL-CIPK信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在解碼生物和非生物脅迫激發(fā)的鈣信號(hào)及信號(hào)的進(jìn)一步傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。CBL家族成員CBL10參與植物抵抗高鹽脅迫、應(yīng)對(duì)病菌侵染、參與分生組織和花器官發(fā)育、調(diào)節(jié)離子平衡等多個(gè)過程,對(duì)其下游互作CIPK家族成員的篩選與鑒定對(duì)于明確上述調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要。為了鑒定林煙草(Nicotiana sylvestris)NsylCBL10下游互作NsylCIPK家族成員,本研究首先以擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtCIPK家族成員和水稻(Oryza sativa)OsCIPK家族成員基因的CDS序列為檢索序列,利用NCBI和中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)林煙草中可能存在的NsylCIPK家族成員進(jìn)行了預(yù)測(cè);然后通過RT-PCR方法對(duì)預(yù)測(cè)到的NsylCIPK家族成員進(jìn)行了克隆并利用生物學(xué)分析軟件對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析;最后通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)鑒定了與NsylCBL10互作的NsylCIPK家族成員。結(jié)果表明,在林煙草中可能存在28個(gè)NsylCIPK家族成員,實(shí)際克隆獲得了20個(gè)NsylCIPK家族成員,在酵母雙雜交體系中與NsylCBL10互作的只有1個(gè)NsylCIPK家族成員NsylCIPK14a。通過PCR以及抗生素抗性篩選鑒定突變體,成功拿到NsylCBL2轉(zhuǎn)煙草突變體、NsylCBL2轉(zhuǎn)擬南芥突變體、擬南芥atcbl3突變體和擬南芥atcbl2atcbl3雙突變體。對(duì)這些突變體進(jìn)行了種子發(fā)育和離子抗性的分析,結(jié)果表明NsylCBL2轉(zhuǎn)擬南芥和轉(zhuǎn)煙草的突變體沒有表現(xiàn)出和對(duì)照之間的明顯的差異。本研究為解析林煙草及其他物種中CBL-CIPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)功能提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S572
【圖文】：

18圖 2.1 NsylCIPK 家族成員鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹分析Figure 2.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of CIPK family members2.3.2 NsylCIPK 家族成員的克隆及結(jié)構(gòu)分析根據(jù)預(yù)測(cè)的 28 個(gè) NsylCIPK 家族成員的 CDS 序列設(shè)計(jì)引物，以林煙草 cDNA 為模板，克隆得到了其中的 20 個(gè)成員。由于擬南芥 AtCIPK 家族成員的功能研究更為深入，為了方便后續(xù)分析和研究，根據(jù)與 AtCIPK 家族成員在進(jìn)化樹中親源關(guān)系的遠(yuǎn)近對(duì)克隆獲得的 NsylCIPK 家族成員進(jìn)行命名(表 2.9)。對(duì)克隆獲得的 20 個(gè) NsylCIPK 家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖 2.2)，結(jié)果表明，該家族成員可以根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分為兩類：第一類包括亞家族 Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3 和 Subgroup4中的成員，都具有少內(nèi)含子特征，僅含有 1~2 個(gè)外顯子；第二類包括 Subgroup5 中的成員，具有多內(nèi)含子特征，含有 12~15 個(gè)外顯子。從進(jìn)化關(guān)系上來看，少內(nèi)含子成員位于進(jìn)化樹的基部，表明進(jìn)化初期 NsylCIPK 家族成員含內(nèi)含子較少，后來逐漸進(jìn)化出多內(nèi)含子成員。

圖 2.2 獲得的 NsylCIPK 家族成員的進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析Figure 2.2 Phylogenetic analysis and gene structures of cloned NsylCIPK genes對(duì)克隆獲得的 20 個(gè) NsylCIPK 家族成員的蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖 2.3)，結(jié)果表明，克隆獲得的 NsylCIPK 家族所有成員都具有 DFG-APE 激活環(huán)結(jié)構(gòu)域、NAF 結(jié)構(gòu)域和 PPI 結(jié)構(gòu)域。說明這三個(gè)結(jié)構(gòu)域在 NsylCIPK 家族成員的進(jìn)化中非常保守，由此可推測(cè)它們?cè)?NsylCIPK 發(fā)揮正常功能的過程中發(fā)揮重大作用。

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1 許迪之;林煙草NsylCIPK家族成員的克隆及其與NsylCBL10的互作分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

2 毛靜靜;林煙草NsylCBL10和NsylCBL5的功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

3 董連紅;林煙草CBL基因家族成員NsylCBL10的功能分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

本文編號(hào)：2713347