【摘要】：甘草(Glycyrrhiza ural ensis Fisch)是豆科多年生草本植物,其根和根莖入藥,具有補(bǔ)脾益氣,清熱解毒,祛痰止咳,調(diào)和諸藥等功效。目前甘草野生資源匱乏,而現(xiàn)階段栽培甘草與野生甘草質(zhì)量存在較大差距。以甘草酸為代表的三萜類及以甘草苷為代表的黃酮類這兩大類主要藥效成分均存在含量低下的問題。因此提高栽培甘草品質(zhì)勢(shì)在必行。殼聚糖是一種真菌代謝物,廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中用于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量,另外,作為誘導(dǎo)子廣泛地應(yīng)用于藥用植物的次生代謝調(diào)控過程中。目前,尚無(wú)殼聚糖誘導(dǎo)調(diào)控甘草次生代謝的報(bào)道。因此我們利用外源殼聚糖誘導(dǎo)甘草整體植物,從代謝組學(xué)與蛋白組學(xué)兩方面研究其對(duì)甘草代謝的影響。另外,本論文對(duì)甘草酸生合成關(guān)鍵酶GuHMG R、GuSQS、Guβ-AS進(jìn)行了工程菌的構(gòu)建。結(jié)果如下:(1)基于LC-MS/MS的甘草次生代謝研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖誘導(dǎo)后,甘草苷含量顯著增加,而甘草酸含量無(wú)明顯變化。結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析共篩選鑒定出34個(gè)差異代謝物。其中18個(gè)黃酮類物質(zhì)均顯著升高,包括10個(gè)黃酮、6個(gè)異黃酮、2個(gè)查爾酮。黃酮類物質(zhì)的變化極具規(guī)律性,認(rèn)為殼聚糖誘導(dǎo)促進(jìn)了黃酮類物質(zhì)的生物合成。而萜類物質(zhì)的變化規(guī)律不明顯。(2)基于NMR的甘草初生代謝研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖誘導(dǎo)后,篩選鑒定出7個(gè)差異初生代謝物,其中包括4個(gè)氨基酸、3個(gè)有機(jī)酸類化合物,這7物質(zhì)均直接或間接的參與到三羧酸循環(huán)中,我們推測(cè),殼聚糖誘導(dǎo)促進(jìn)了三羧酸循環(huán)。(3)基于ELISA的甘草激素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),殼聚糖誘導(dǎo)后脫落酸(ABA)含量顯著降低,其它四種激素,生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GA3、GA4)、茉莉酸甲酯(MeJA)的含量均顯著升高。(4)基于iTRAQ的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖誘導(dǎo)后,461個(gè)蛋白質(zhì)被鑒定為差異蛋白,其中201個(gè)差異蛋白表達(dá)被下調(diào),包括光合作用相關(guān)蛋白(LHCA類、LHCB類、Psa類、Psb類、Pst類、atp類蛋白),260個(gè)差異蛋白表達(dá)被上調(diào),包括苯丙素生合成途徑相關(guān)蛋白(PAL)、黃酮生合成途徑相關(guān)蛋白(PAL、CHS、PKR、CHI、VR);差異蛋白的GO注釋及功能富集提示,甘草光合作用、次生代謝過程等生物學(xué)過程被顯著富集;甘草光合作用場(chǎng)所類囊體、質(zhì)體或色素體等細(xì)胞定位被顯著富集,結(jié)合差異蛋白定量研究結(jié)果,共同說(shuō)明:殼聚糖誘導(dǎo)減弱了甘草光合作用電子傳遞過程;差異蛋白的KEGG通路注釋及功能富集分析提示:甘草光合作用、光合作用天線蛋白、苯丙素生合成途徑生合成途徑被顯著富集到;結(jié)合差異蛋白定量研究結(jié)果,共同說(shuō)明:殼聚糖誘導(dǎo)顯著的抑制了甘草的光合作用。(5)基于前人構(gòu)建的GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS的克隆載體,采用不同的表達(dá)載體構(gòu)建方法,均成功的構(gòu)建表達(dá)載體,進(jìn)而構(gòu)建GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS的大腸桿菌工程菌,且成功的表達(dá)出了 GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS。綜上所述,殼聚糖對(duì)甘草代謝的影響總結(jié)如下(1)殼聚糖誘導(dǎo)引起三羧酸循環(huán)(TCA)的增強(qiáng),TCA循環(huán)為次生代謝產(chǎn)物的合成提供充足的底物,因而一方面促進(jìn)了甘草黃酮的生物合成,另一方面促進(jìn)了甘草內(nèi)源激素的合成。(2)TCA循環(huán)的增強(qiáng)顯著上調(diào)了 PAL、CHS、PKR、CHI、VR這五個(gè)貫穿甘草黃酮生合成始終的酶,導(dǎo)致甘草黃酮整條代謝途徑被激活。所以,PAL、CHS、PKR、CHI、VR可能是甘草黃酮提高的關(guān)鍵所在。(3)甘草黃酮提高的同時(shí),對(duì)自身的光合作用產(chǎn)生了反饋抑制,使甘草光合作用相關(guān)酶(LHCA類、LHCB類、Psa類、Psb類、Pst類、atp類蛋白)顯著下調(diào);甘草光合作用相關(guān)酶顯著下調(diào)另一方面也可能是由于響應(yīng)甘草內(nèi)源激素(IAA、GA3、GA4、MeJA)水平的改變所致。本研究為甘草的次生代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ),而且為GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS的功能研究及體外研究奠定基礎(chǔ)。為甘草品質(zhì)的提高提供參考,為其它藥用植物資源的次生代謝調(diào)控提供借鑒。
【圖文】：

萜類化合物是植物界廣泛存在的一類化合物，是由異戊二烯為基本單位組成的聚逡逑合物及其衍生物的總稱。蔽類化合物合成途徑之一是甲輕戊酸（Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ邋ｐａｔｈｗａｙ，逡逑ＭＶＡ）途徑，見圖１－１。逡逑ｒ邋—逡逑ｒｒ邋Ｔ逡逑W—邐逡逑圖１－１邋ＭＶＡ途徑逡逑ＭＶＡ途徑在植物的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行［６２］，以糖酵解產(chǎn)物乙酰輔酶Ａ為原初供體，合成倍逡逑半萜、三萜類等化合物。萜類化合物還有另外一條生合成途徑－３－磷酸甘油醛／丙酮酸逡逑途徑（甘油醛磷酸／丙酮酸途徑，ＤＸＰ），主要在質(zhì)體中進(jìn)行。以戊糖磷酸途徑產(chǎn)生的甘逡逑油醛－３－磷酸為原初供體，合成單萜，二萜，多萜類等化合物。異戊烯基焦磷酸（ＩＰ逡逑Ｐ）形成機(jī)制的不同是以上兩條途徑的不同之處。各種萜類化合物的形成主要起始于ＩＰ逡逑Ｐ和ＤＭＡＰＰ，，１分子ＩＰＰ作為活化的異戊二烯單元，與１分子它的異構(gòu)體丫，丫－二甲基逡逑丙烯酯（ＤＭＡＰＰ）頭尾縮合生成具有１０個(gè)碳結(jié)構(gòu)骨架的牦牛兒基焦磷酸（ＧＰＰ），ＧＰＰ加逡逑上第二個(gè)ＩＰＰ單元形成法尼基焦磷酸（ＦＰＰ）。ＦＰＰ與其異構(gòu)體焦磷酸苦橙油酯聚合可形逡逑１８逡逑

２．４研宄方案與技術(shù)路線逡逑２．邋４．１技術(shù)路線逡逑見圖２－１如下所示逡逑Ａ逡逑邐邋ＥＬＩＳＡ邐邐逡逑次生代邋ＬＣ＿邋＿差異代謝物———逡逑，——邐＾邐謝物邐ＭＳ／ＭＳ邐含眚變化逡逑外邋＾邐＿邐逡逑謝＿初生代邐ＮＭＲ邐差異代逡逑組邐謝物邐謝物代邐殼逡逑充邐學(xué)邐邐邋謝途徑邐聚逡逑聚邐糖逡逑辦邐誘逡逑糖邐導(dǎo)逡逑誘邐對(duì)逡逑導(dǎo)邐Ｚ逡逑甘邐代逡逑革邐謝逡逑１邐白功能〕邐ｊ逡逑其邐—＾邐影逡逑＾邐＾邐ｉＴＲＡＱ邋￣￣邐響逡逑２邐Ｉ邐￣！標(biāo)記邐蛋白聚類逡逑飯邐曰—邐逡逑Ａｊｎ邐ｉＳｉ邐邐＾邋ＬＣ邐（邐＾逡逑線ｉ邐ＭＳ／ＭＳ邐差異蛋白質(zhì)逡逑丨、含量變化逡逑邐逡逑２５逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.71

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本文編號(hào)：2710728