【摘要】：本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,從寧夏枸杞“寧杞1號”各個時期的混合花藥中克隆了 3個14-3-3蛋白家族基因的cDNA,分別命名為Lb14-3-3a、Lb14-3-3b和Lb14-3-3c,并對這3個基因進行了生物信息學分析,時空表達、遺傳轉(zhuǎn)化和分子功能初步分析,具體研究結(jié)果如下:(1)采用RT-PCR技術(shù),從“寧杞1號”花藥中克隆了Lb14-3-3a、Lb14-3-3b和Lb14-3-3c基因的ORF,Lb14-3-3a基因的ORF長為768 bp,可編碼255個氨基酸,分子量為61.9 kD,等電點為4.99;Lb14-3-3b基因的ORF長為747 bp,可編碼248個氨基酸,分子量為63.09 kD,等電點為4.62;Lb14-3-3c基因OF長為777 bp,可編碼258個氨基酸,分子量為64.14kD,等電點為4.95,它們都屬于14-3-3蛋白超基因家族,且這3個蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成。(2)qRT-PCR分析表明,這三個枸杞花藥蛋白家族基因在枸杞的不同組織、器官、不同花藥發(fā)育時期都有表達,Lb14-3-3a基因在果實和花中優(yōu)勢表達,而在根莖葉中表達量相對較低,且在花藥發(fā)育早期表達量相對較低,造孢細胞時期開始增加,到小孢子母細胞時期達到峰值,四分體時期開始下降,成熟花粉粒時期表達量最低;Lb14-3-3b基因在枸杞的花與果實中表達量較高,根、莖、葉中表達量較低,花藥發(fā)育早期表達量相對較低,四分體時期開始增加,到二核花粉時期達到峰值;Lb14-3-3c基因在雄蕊中的表達量最高,在根、莖、葉,青果、紅果、雌蕊、花瓣和花萼中的表達均較低,在小孢子母細胞時期表達量最高,成熟花粉粒時期表達量最低,推測該蛋白家族基因參與枸杞花器官生長發(fā)育的調(diào)控。(3)構(gòu)建了植物過表達載體Lb14-3-3b-pC1305.1-35S和Lb14-3-3c-pC1305.1-35S。采用農(nóng)桿菌介導途徑將實驗室前期構(gòu)建的植物過表達載體pMDC83-Lb14-3-3a和Lb14-3-3b-pC1305.1-35S轉(zhuǎn)入“三生煙”煙草中,結(jié)果表明,獲得了 6株轉(zhuǎn)Lb14-3-3a基因煙草植株,陽性轉(zhuǎn)化率為54.5%,轉(zhuǎn)Lb14-3-3煙草植株生長速度較快,有4株花器官出現(xiàn)畸變,出現(xiàn)喇叭型對稱的6片花瓣,且柱頭高于雄蕊,這與枸杞雄性不育突變體“寧杞5號”柱頭和花藥特征相一致;并獲得9株陽性轉(zhuǎn)Lb14-3-3b基因煙草植株,陽性轉(zhuǎn)化率為75%,轉(zhuǎn)基因煙草植株生長緩慢,有5株花器官出現(xiàn)畸變,出現(xiàn)花瓣缺失現(xiàn)象,有4片花瓣致使整個花型成四角型,缺少1個花絲,花藥發(fā)育不完全,致使煙草植株難以完成正常的有性生殖,推測枸杞Lb14-3-3a和Lb14-3-3b基因可能影響了煙草植株的生長發(fā)育,在花粉的的敗育過程中起著一定的調(diào)控作用。研究結(jié)果為深入探討Lb14-3-3蛋白家族基因?qū)﹁坭交ㄆ鞴偌拌坭街仓晟L發(fā)育的調(diào)控作用提供了理論參考,同時也為拓展Lb14-3-3蛋白在植物生長發(fā)育中的調(diào)控機制和分子機理提供了新思路。
【圖文】：

被認為是祖先，協(xié)助細胞核組織完成基本功能，且ｓ組成員進化較早［１８＿１９］。逡逑一般情況下，１４－３－３蛋白形成了一個保守的真核家族．通過與多種靶點的磷酸化依賴性相互逡逑作用而發(fā)揮作用（圖１－２），蛋白質(zhì)磷酸化的絲氨酸殘基在特定的基序成為１４－３－３蛋白結(jié)合的目標．逡逑通過與其中任一機制相互作用可導致目標蛋白的行為發(fā)生改變％］，磷酸化特異性地修飾蛋白后．逡逑可使蛋白發(fā)揮正常的功能，關(guān)于玉米早期和擬南芥0４ｒａ６／辦花藥發(fā)育的過程表明，磷逡逑酸化激酶、與染色質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)、磷酸酶與植物體內(nèi)的１４－３－３蛋白質(zhì)相互結(jié)合，在植物發(fā)育過逡逑程中起著重要的調(diào)控作用＾２２］。逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｉ邋ｔ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｊ邋｜邋Ｐｒ0ｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ逡逑＞】夂）逡逑Ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ逡逑Ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ｓｔａｂｉｌｉｔｙ逡逑Ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ｓｕｂ－ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ逡逑Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋ｏｔｈｅｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑圖１－２邋１４－３－３蛋白的一般功能（引自Ｂｏｓｔｏｎ等，２００１）逡逑－２－逡逑

邐第一章引言逡逑胞核分裂的幾率，致使ＢＲ途徑參與調(diào)控植物細胞核的伸長和分裂（圖１－４）。逡逑」邐＼邋ｔｅ’邋Ｌ邐一二逡逑＿＿＼邋｜邋—邐ｆ邐ｉ逡逑＇＇寧⑥邐！逡逑；？ＡＫｌｉ＾３＞邐ｔ邋＼邐／逡逑＿邐＿邐�。�，？＞＞邐邐Ｖ逡逑，邋／逡逑ｐｒｍａｓｏｍｅ＾邋、、邋ｎｕｃｌｅｕｓ＾邋ｘ邋＾逡逑ｐｂｓｍａ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邐ｃｙｔｏｓｏｌ邐逡逑圖１－４邋１４－３－３蛋白在ＢＲ信號轉(zhuǎn)導中的作用（引自Ｃｕｔｌｅｒ等，２０１０）逡逑脫落酸（ＡＢＡ）主要功能包括響應非生物脅迫、生物脅迫脅迫和種子發(fā)育，１４－３－３蛋白的表達逡逑己被證明受到ＡＢＡ的影響［３４］，，有研宄表明，在植物體內(nèi)．ＡＢＡ反應元件被ｓｎｆｌ相關(guān)激酶２家族逡逑成員ＳｎＲＫ２蛋白激酶磷酸化，這些激酶由于ＡＢＡ信號傳導而被激活，同時，這種磷酸化響應逡逑ＡＢＡ增加了邋ＡＢＦ３（ＡＢＦ３為１４－３－３蛋白的三個亞型）的穩(wěn)定性，缺乏１４－３－３結(jié)合位點的突變型逡逑ＡＢＦ３則降低了這種效應［３５－３６］；鈣依賴蛋白激酶（ＣＤＰＫｓ）是一種直接結(jié)合Ｃａ２＋
【學位授予單位】：寧夏大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.19

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