【摘要】：內(nèi)生真菌誘導子作為一種特殊的化學信號,可誘發(fā)植物細胞產(chǎn)生一系列與信號分子相關(guān)的生理生化效應,進而誘導特定的基因表達,激活次生代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性,最終導致次生代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生變化。然而,目前有關(guān)內(nèi)生真菌誘導子誘導藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成的信號轉(zhuǎn)導等相關(guān)機制尚不完全清楚。本研究以苦豆子組培苗為研究對象,4株苦豆子內(nèi)生真菌的菌液濃縮物為真菌誘導子,考察其對苦豆子組培苗中氧化苦參堿(Oxymatrine,OMA)合成的影響,通過測定內(nèi)生真菌誘導苦豆子中防御酶的活性,探究內(nèi)生真菌促進生物堿合成積累的生理防衛(wèi)反應機制;在內(nèi)生真菌誘導子作用下,分析宿主中主要信號分子和次生代謝物OMA含量的變化規(guī)律,初步探討苦豆子內(nèi)生真菌誘導子對宿主中關(guān)鍵信號分子及生物堿的影響;利用實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR),建立檢測苦豆子生物堿合成關(guān)鍵酶一賴氨酸脫羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)基因表達的方法,研究內(nèi)生真菌誘導子對宿主中生物堿合成關(guān)鍵酶基因表達的影響,在此基礎(chǔ)上,分析該基因的表達與宿主中OMA含量及信號分子之間的關(guān)系,揭示內(nèi)生真菌誘導苦豆子生物堿合成積累的作用機制。結(jié)果如下:1、以苦豆子內(nèi)生真菌的菌液濃縮物為誘導子,研究4種不同內(nèi)生真菌誘導子對苦豆子組培苗OMA的生物合成及生理防衛(wèi)反應的影響。結(jié)果表明:4種苦豆子內(nèi)生真菌的菌液濃縮物均可提高宿主中OMA含量的積累,其中誘導效果最佳的是內(nèi)生真菌誘導子XKYKDF40,在0～15d的誘導期間宿主中OMA含量持續(xù)增長且始終高于對照,在15 d達到最高,為3.616 mg/g,是對照組15 d的2.09倍。4種內(nèi)生真菌誘導子還可誘發(fā)宿主中3種抗氧化酶(POD、APX和CAT)和生物堿合成關(guān)鍵酶PAL的活性升高。2、在內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF11和XKYKDF40的作用下,分析在不同誘導時間下,宿主中主要信號分子NO、SA和JA含量以及主要活性成分OMA的變化規(guī)律,探究內(nèi)生真菌誘導子誘發(fā)的信號分子同OMA含量及防御酶活性變化的關(guān)系,結(jié)果表明:在內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF11和XKYKDF40處理苦豆子組培苗后,首先誘發(fā)了信號分子NO迸發(fā),其次內(nèi)源SA和JA的釋放,他們達到最大值的時間分別在誘導第3、9和12 d,且在誘導過程中,3種信號分子參與調(diào)控PAL、APX和CAT活性的變化,隨后宿主中OMA含量的達到高峰�？赏茰yNO、SA、JA三者聯(lián)合介導內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF11和XKYKDF400促進苦豆子OMA的合成。NO的迸發(fā)是苦豆子組培苗在內(nèi)生真菌誘導子處理下出現(xiàn)最早的反應之一,信號分子SA和JA對內(nèi)生真菌誘導子促進OMA的合成有著拮抗或協(xié)調(diào)互補的作用。3、根據(jù)苦豆子LDC和Lectin基因序列設(shè)計目的和內(nèi)參基因,采用相對定量的方法,優(yōu)化qRT-PCR反應體系與反應條件,建立苦豆子生物堿合成關(guān)鍵酶—LDC基因表達的檢測方法。結(jié)果表明:在qRT-PCR體系中cDNA濃度為200ng/μL,退火溫度為61℃時檢測結(jié)果最好;所構(gòu)建的目的基因QLDC和內(nèi)參基因Lectin的標準曲線,其循環(huán)閾值與模板濃度均呈良好的線性關(guān)系,擴增效率都在99%以上;與半定量PCR相比,qRT-PCR的靈敏度提高了 25倍；以內(nèi)生真菌XKYKDF40菌液濃縮物為誘導子,發(fā)現(xiàn)宿主中LDC基因的表達量始終與OMA含量協(xié)同增長,在誘導處理第15 d時,LDC基因表達量達到最高,為誘導0d的260.95倍。4、在建立了穩(wěn)定的qRT-PCR檢測苦豆子LDC基因表達反應體系的基礎(chǔ)上,分析內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF11對生物堿合成關(guān)鍵酶基因表達的影響,探究LDC基因表達與宿主中OMA含量及信號分子之間的關(guān)系。結(jié)果表明:內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF11明顯促進了宿主中LDC基因的表達,且在各個誘導時間段內(nèi),都高于同時期的對照組。在誘導0～12 d內(nèi),LDC基因表達量和OMA含量持續(xù)增長,在第12 d時LDC基因的表達量達到頂峰,為誘導0 d的394.41倍,是同時期對照組的21.26倍。結(jié)合宿主中信號分子的變化情況,發(fā)現(xiàn)誘導處理期間JA與LDC基因表達量基本保持同步變化,推測JA參與介導內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF11促進LDC基因的表達。
【圖文】：

１６０００００邋－逡逑１４０００００邋－逡逑＾邋１２０００００邋－逡逑Ｉ邋１００００００邋－逡逑，８０００００邋－逡逑＾邋６０００００邋－逡逑４０００００邋－逡逑０邐５邐１０邐１５邐２０邐２５邐３０逡逑時間邋Ｔｉｍｅ／ｍｉｎ逡逑圖２－２苦豆子組培苗中ＯＭＡ的高效液相色譜圖逡逑邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＯＭＡ邋ｉｎ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋５＊．邋ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ邋Ｌ．邋ｂｙ邋ＨＰＬＣ逡逑曲線的制備逡逑Ａ標準品２．０邋ｍｇ，用流動相溶解定容至１邋ｍＬ，配制濃度為２邋ｍｇ準Ｐｔ備液，梯度稀釋成濃度為２０００、１０００、５００、２００、１００和述色譜條件，吸取標準品溶液進樣，，每次進樣１０邐以濃度（ｙ），進行線性回歸并繪制標準曲線，其回歸方程為：ｙ＝７９氧化苦參堿濃度在０．００２￣２．０００ｍｇ／ｍｌ范圍內(nèi)，峰面積線性關(guān)系１００００００邐＾７９４邋９邋ｘ＋１１７１３．２邋ｒ２＝0．邋９９９０逡逑

續(xù)光照１２ｈ，光強為１０００邋ｌｘ，包括添加誘導子當天在內(nèi)每３ｄ�。贝�，共速凍后，－８０°Ｃ保存。逡逑子組培苗中ＮＯ含量測定逡逑Ｇｒｅｉｓｓ試劑法［１４３］測定組培苗中ＮＯ含量，配制ＮａＮ０２標準品溶液，濃度從、２．５、２、１．５、ｌ｜＿ｉｍｏｌ／ｍＬ，繪制ＮａＮ０２＃準曲線。�。希欤缈喽棺訜o菌苗子上研磨至勻漿，１００００ｇ，邋４°Ｃ離心１５ｍｉｎ，取上清，置冰上待測，按照表３－１２＃準曲線中計算ＮＯ含量。逡逑表３－１邋ＮＯ含量測定操作表逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ邋ｔａｂｌｅ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ＮＯ逡逑試劑名稱邐測定管邐空白管樣品（叫）邐１００逡逑提取液（ｎｌ）邐１００逡逑試劑一（ｎＬ）邐５０邐５０逡逑試劑二（ｊｉＬ）邐５０邐５０逡逑棍勻，室溫靜置１０ｍｉｎ，于微量石英比色皿／９６孔板，測定Ａ５５Ｑ下的吸光值，ＡＡ＝ＡＭ－０．０８「邋１逡逑
【學位授予單位】：寧夏大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S567.2

【參考文獻】

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本文編號：2695294