發(fā)布時間：2020-04-30 00:01

【摘要】：豆科植物的根瘤共生系統(tǒng)是自然界最主要的生物固氮來源。根瘤菌感知豆科植物產(chǎn)生的黃酮類化合物時分泌結(jié)瘤因子被視為共生信號傳導(dǎo)過程起始。而百脈根結(jié)瘤因子受體NFR1和NFR5是感知結(jié)瘤因子的重要節(jié)點。豆科植物根瘤形成過程,尤其是早期共生關(guān)系建立過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的深入解析對于揭示根瘤早期發(fā)育中共生和免疫系統(tǒng)的協(xié)同調(diào)控具有重要意義。目前NFR1下游信號傳遞機(jī)制仍沒有得到完全的闡明,因此鑒定與LjNFR1互作的蛋白并揭示其共生信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是研究的重點。本研究以百脈根結(jié)瘤因子受體激酶LjNFR1為誘餌,通過建立百脈根根瘤共生不同時期的酵母膜雙雜文庫篩選獲得了一個與之互作的生長素相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白Lj5NG4,并以此為研究對象,分析Lj5NG4在百脈根中共生固氮的功能以及作用機(jī)制,主要的研究結(jié)果如下:1.利用系統(tǒng)發(fā)育樹分析不同物種5NG4蛋白,發(fā)現(xiàn)Lj5NG4屬于nodulin MtN21/EamA-like transporter蛋白家族,受生長素誘導(dǎo)調(diào)控,其同源蛋白被證實為生長素轉(zhuǎn)運蛋白。將百脈根中已知的生長素轉(zhuǎn)運蛋白與Lj5NG4共同進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)Lj5NG4與已知的轉(zhuǎn)運蛋白家族處于不同的進(jìn)化分支。2.借助tYFP熒光蛋白信號的顯微鏡觀察證實了Lj5NG4在侵染前期根毛中強(qiáng)烈表達(dá),而在后期根瘤內(nèi)部不表達(dá),預(yù)示Lj5NG4更多的在共生侵染前期發(fā)揮功能。3.為進(jìn)一步證實百脈根中Lj5NG4蛋白與LjNFR1蛋白相互作用的存在,利用酵母雙雜交以及煙草體內(nèi)異源系統(tǒng)進(jìn)行驗證,均表明存在互作。4.利用CRISPR/Cas9對Lj5NG4進(jìn)行基因敲除,通過百脈根穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,經(jīng)過兩代篩選得到T2代純合穩(wěn)定突變株。其共生表型統(tǒng)計結(jié)果表明Lj5NG4在共生固氮前期抑制侵染線的形成,對前期侵染進(jìn)行負(fù)調(diào)控,但對后期結(jié)瘤沒有顯著影響�；パa(bǔ)實驗進(jìn)一步證實該結(jié)果。5.鑒于Lj5NG4可能是生長素轉(zhuǎn)運子,通過外源施加不同濃度生長素進(jìn)一步確認(rèn)生長素能否對突變體表型產(chǎn)生影響。發(fā)現(xiàn)低濃度(10-7、10-8、10-9 M)的生長素會減弱Lj5NG4突變后侵染線增加的表型,對共生侵染和根瘤發(fā)育發(fā)揮正調(diào)控功能。大豆皂苷對于調(diào)控大豆性狀品質(zhì)有重要意義,在皂苷合成途徑中B-香樹脂醇合成酶(AMS)是關(guān)鍵的限速酶,研究意義非常重要。金華南老師課題組將大豆AMS的啟動子作為誘餌進(jìn)行酵母單雜篩選,得到大豆Glyma04G、Glyma06G,屬于bHLH蛋白家族。由于大豆基因組存在基因倍增,給研究帶來很多不便,將其同源基因Lj1g3v2098310.1放在模式植物百脈根中進(jìn)行研究,并將其命名為LjbHLH93,以此為研究對象,初步探究該基因?qū)采Y(jié)瘤帶來的影響,主要的研究結(jié)果如下:1.借助tYFP熒光蛋白信號的顯微鏡觀察證實LjbHLH93在幼嫩的根瘤中不表達(dá),而在后期根瘤內(nèi)部的侵染細(xì)胞中有強(qiáng)烈的表達(dá),這預(yù)示著LjbHLH93可能更多的通過調(diào)控成熟根瘤侵染細(xì)胞從而影響結(jié)瘤。2.通過凝膠阻滯遷移實驗未能驗證百脈根中LjbHLH93蛋白與LjAMS互作,酵母體內(nèi)單雜交進(jìn)行互作驗證發(fā)現(xiàn)LjAMS在酵母中存在自激活,亦無法驗證LjbHLH93與LjAMS相互作用。3.通過CRISPR/Cas9技術(shù)對LjbHLH93進(jìn)行敲除,未能獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的突變株,但毛根轉(zhuǎn)化得到的突變株根瘤數(shù)目有顯著減少。而通過超表達(dá)技術(shù)未能觀察到突變株的共生表型有顯著變化。
【圖文】：

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋）和根瘤器官發(fā)生（ｎｏｄｕｌｅｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）。宿主植物對結(jié)瘤因子的感知可逡逑以引發(fā)植物中一系列的分子和生理反應(yīng)，例如早期共生基因的累積、根毛卷曲和侵逡逑染線（ＩＴ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｒｅａｄ）的形成（圖１－２）。細(xì)菌可以分裂并向皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)展（Ｇａｇｅ逡逑ｅｔａｌ２００４）。盡管剛開始根瘤菌的感知發(fā)生在表皮，但后期持續(xù)的信號傳導(dǎo)對于根瘤逡逑菌的侵染和釋放的過程都非常重要（Ｃａｐｏｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００５，邋Ｄｅｎ邋Ｈｅｒｄｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００７）。逡逑根瘤菌侵染通過宿主衍生的管狀隔室發(fā)生，具有根毛的表皮細(xì)胞彎曲包裹著根逡逑瘤菌向內(nèi)生長，從而形成侵染線。這種生理變化伴隨著根毛極性生長的重新定向，逡逑產(chǎn)生捕獲細(xì)菌微菌落以形成“侵染區(qū)室”（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｃｈａｍｂｅｒ）這種牧羊人鉤結(jié)構(gòu)逡逑ＯＭｆｉｅｚ邋ｅｔａｌ邋２０１７）。從這一點來看，根毛細(xì)胞膜內(nèi)陷并開始向表皮細(xì)胞內(nèi)部伸長，逡逑帶動根瘤菌在侵染線內(nèi)部增殖并往下移動，與此同時，，皮層細(xì)胞被重新激活進(jìn)行有逡逑絲分裂以形成根瘤原基，從而起始根瘤器官發(fā)生過程。侵染線向根內(nèi)部生長到達(dá)根逡逑瘤原基

＾邐身邋Ｒｈｉｚｏｂｌｕｍ逡逑圖１－１豆科植物與根痛菌相互作用（Ｃｌｕａｅｔａｌ２０１８）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｌｅｇｕｍｅｓ邋ａｎｄ邋ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ逡逑豆科植物形成有效根瘤依賴著兩個相互協(xié)同的過程：根瘤菌侵染（ｒｈｉｚｏｂｉａ逡逑ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋）和根瘤器官發(fā)生（ｎｏｄｕｌｅｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）。宿主植物對結(jié)瘤因子的感知可逡逑以引發(fā)植物中一系列的分子和生理反應(yīng)，例如早期共生基因的累積、根毛卷曲和侵逡逑染線（ＩＴ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｒｅａｄ）的形成（圖１－２）。細(xì)菌可以分裂并向皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)展（Ｇａｇｅ逡逑ｅｔａｌ２００４）。盡管剛開始根瘤菌的感知發(fā)生在表皮，但后期持續(xù)的信號傳導(dǎo)對于根瘤逡逑菌的侵染和釋放的過程都非常重要（Ｃａｐｏｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００５，邋Ｄｅｎ邋Ｈｅｒｄｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００７）。逡逑根瘤菌侵染通過宿主衍生的管狀隔室發(fā)生，具有根毛的表皮細(xì)胞彎曲包裹著根逡逑瘤菌向內(nèi)生長，從而形成侵染線。這種生理變化伴隨著根毛極性生長的重新定向，逡逑產(chǎn)生捕獲細(xì)菌微菌落以形成“侵染區(qū)室”（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｃｈａｍｂｅｒ）這種牧羊人鉤結(jié)構(gòu)逡逑ＯＭｆｉｅｚ邋ｅｔａｌ邋２０１７）。從這一點來看，根毛細(xì)胞膜內(nèi)陷并開始向表皮細(xì)胞內(nèi)部伸長，逡逑帶動根瘤菌在侵染線內(nèi)部增殖并往下移動
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S541.6

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