【摘要】：植酸是磷的主要儲(chǔ)存形式,它作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子,是阻礙植物吸收礦物質(zhì)和降低動(dòng)物飼料磷利用率的最主要因素。植酸酶的研究和開發(fā)可以有效解決這一問題。目前,人們多利用細(xì)菌、真菌和植物等表達(dá)系統(tǒng)重組并生產(chǎn)植酸酶,并且應(yīng)用廣泛。但仍舊需要更加綠色、優(yōu)質(zhì)和高效的植酸酶表達(dá)系統(tǒng)。蛹蟲草作為一種食用藥用真菌,其成分具有調(diào)節(jié)免疫功能以及抗炎等藥用活性,具備生長(zhǎng)周期短,安全性好等優(yōu)點(diǎn),因此被認(rèn)為是重組表達(dá)植酸酶的良好受體材料,但目前尚未報(bào)道利用蛹蟲草作為表達(dá)載體重組植酸酶。本試驗(yàn)利用蛹蟲草作為表達(dá)載體,將含有植酸酶phyA基因真菌表達(dá)載體pCB130NG轉(zhuǎn)入到蛹蟲草菌株中,通過測(cè)定蛹蟲草重組表達(dá)植酸酶的表達(dá)量和酶活情況。再獲得產(chǎn)植酸酶蛹蟲草菌株的同時(shí),大量發(fā)酵進(jìn)行接下來肉雞飼料添加實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選擇了1日齡AA肉雞144只,隨機(jī)分為6個(gè)處理組,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)有8只肉雞。處理組T0為正常日糧組,處理組T1為正常日糧添加野生型蛹蟲草,處理組T2為正常日糧添加市售植酸酶500 U/kg,處理組T3-T5為正常日糧添加產(chǎn)植酸酶蛹蟲草,添加水平分別為250 U/kg、500 U/kg和1000 U/kg。試驗(yàn)日期為42天,分前期1-21日齡和后期22-42日齡。分別探究了產(chǎn)植酸酶蛹蟲草對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能、脛骨發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率以及免疫器官指數(shù)的影響,具體研究結(jié)果如下:1.本試驗(yàn)利用重組質(zhì)粒pCB130NG-phyA轉(zhuǎn)入蛹蟲草原生質(zhì)體中,通過PCR檢測(cè)以及Western Blot檢測(cè)得到了轉(zhuǎn)phyA基因的蛹蟲草菌株,ELISA測(cè)定phyA基因重組蛋白表達(dá)量最高約占總可溶蛋白的0.91±0.064‰,利用鉬釩酸銨比色法測(cè)定每克產(chǎn)植酸酶蛹蟲草菌株凍干粉中植酸酶酶活為402.2 U。2.在肉雞生長(zhǎng)性能方面,在1-21日齡和22-42日齡處理組T2、T4和T5三組可顯著提升肉雞平均體重(P0.05),同時(shí)處理組T2、T4和T5三組在平均日增重和平均日采食量方面均有顯著提高(P0.05)。在1-42日齡時(shí),處理組T2、T4和T5三組肉雞的料重比與對(duì)照組差異顯著(P0.05)。3.在脛骨指標(biāo)方面,在21日齡和42日齡時(shí)處理組T2、T4和T5三組相比于對(duì)照組脛骨灰分含量具有明顯提升(P0.05),同樣對(duì)脛骨中磷含量水平有明顯提高(P0.05)。在21日齡時(shí),處理組T2、T4和T5三組處理組對(duì)肉雞脛骨中鈣含量有明顯提升(P0.05),在42日齡時(shí)處理組T5結(jié)果表示明顯提升肉雞脛骨中鈣含量(P0.05)。4.在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率方面,在21日齡和42日齡時(shí),添加植酸酶處理組T2、T4和T5三組的粗蛋白利用率較比于對(duì)照組T0顯著提升(P0.05)。在磷利用率方面,21日齡和42日齡,添加植酸酶的四個(gè)處理組T2-T5相比于對(duì)照組T0差異顯著(P0.05)。在鈣利用率方面,21日齡下添加植酸酶的四個(gè)處理組T2-T5明顯提高肉雞鈣利用率(P0.05),在42日齡下,處理組T2、T4和T5可明顯提高鈣利用率(P0.05)。5.在免疫器官指數(shù)方面,日糧中添加產(chǎn)植酸酶蛹蟲草相比于對(duì)照組,肉雞免疫器官指數(shù)有增加趨勢(shì)。
【圖文】：

第三章 結(jié)果與分析.1 利用蛹蟲草表達(dá)植酸酶1.1 蛹蟲草的遺傳轉(zhuǎn)化取三塊 1 cm 蛹蟲草菌塊接種于 PDA 液體培養(yǎng)基中，利用混合酶液溶解細(xì)胞壁獲草原生質(zhì)體；利用 PEG 轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的含有 phyA 基因的 pCB130NG 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蛹生質(zhì)體置于 PDA 再生培養(yǎng)基（潮霉素+卡那霉素為 Hyg650 mg/L+Kan300 mg/L）。長(zhǎng)出的單一轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。具體過程如圖 3.1。

圖 3.2 轉(zhuǎn) pCB130NG-phyA 質(zhì)粒蛹蟲草菌株的 PCR 檢測(cè)結(jié)果M: DL2000 DNA Marker；+:陽性對(duì)照；－:陰性對(duì)照；1~14:再生蛹蟲草菌株Fig 3.2 PCR analysis of transgenic pCB130NG-phA Cordyceps militarisM: DL2000 DNA Marker;+: Positive control；－: Negative control;1~14: Cordyceps militaris regrowth PCR determination基因蛹蟲草的 Western Blot 檢測(cè)了驗(yàn)證 phyA 基因在蛹蟲草中的表達(dá)情況，以野生型蛹蟲草菌株作為陰性R 檢測(cè)為陽性的菌株進(jìn)行同時(shí)進(jìn)行 Western Blot 檢測(cè)，結(jié)果如圖 3.3 所示蛹蟲草菌株在 68 kDa 處有目的條帶，相比于理論計(jì)算的蛋白條帶約 64.是糖基化造成的。而野生型蛹蟲草沒有檢測(cè)到目的蛋白片段，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入到蛹蟲草中，，蛹蟲草成功表達(dá)植酸酶蛋白。用 ELISA 試劑盒測(cè)定產(chǎn)植酸酶 phyA 基因蛹蟲草菌株的表達(dá)量。phyA 基因量最高約占總可溶蛋白的 0.91 ±0.064 ‰，將鑒定的高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蛹蟲實(shí)驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S567.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳鴻雪;王忠;王錦峰;王長(zhǎng)文;;蛹蟲草人工栽培及開發(fā)研究進(jìn)展[J];福建農(nóng)業(yè)科技;2019年01期

2 閆麗麗;;影響蛹蟲草生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的因素[J];農(nóng)業(yè)科技與裝備;2019年03期

3 周影;錢琨;王芹;劉娟;祝長(zhǎng)杰;張春楊;張?jiān)?張俊輝;;蛹蟲草食品的研究進(jìn)展[J];農(nóng)家參謀;2019年15期

4 石(韋華)韜;吳婧婧;;不同方式培育的蛹蟲草成本核算和經(jīng)濟(jì)效益分析——以江蘇省徐州市某蛹蟲草生產(chǎn)企業(yè)為例[J];廣西蠶業(yè);2019年03期

5 肖淑媛;胡長(zhǎng)生;;蛹蟲草的規(guī)范化栽培技術(shù)[J];新校園(上旬);2016年09期

6 陳姝嫻;;冬蟲夏草與蛹蟲草之辨析[J];養(yǎng)生月刊;2017年02期

7 許y斏

本文編號(hào)：2642042