云杉屬樹種是中國和世界植物資源中重要的森林樹種,有很高的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值。關(guān)于該屬樹種的核型模式、系統(tǒng)分類和起源進化關(guān)系等的研究具有重大的生物學(xué)與林學(xué)意義。本研究以7種云杉天然林的種子為材料,在常規(guī)染色體制片法的基礎(chǔ)上,對云杉中期染色體制備技術(shù)進行優(yōu)化并建立了完善的制片體系;采用同源序列法克隆了18S rDNA和25S rDNA基因片段,經(jīng)序列測定分析后確定其為雙色熒光原位雜交的探針,對7種云杉的中期染色體進行基因定位。為各云杉同源染色體識別、近緣種親緣關(guān)系分析和系統(tǒng)發(fā)育研究提供了有效的方法。主要研究結(jié)果如下:1.優(yōu)化去壁低滲火焰干燥制片法,篩選出最理想的預(yù)處理條件是0.1%秋水仙素（含1%二甲基亞楓）在23℃轉(zhuǎn)速為115 rpm的搖床里暗處理6.5 h;酶解條件是根尖在（2%纖維素酶+1%果膠酶溶液）酶混合溶液中37℃解離70-75 min,得到了分散程度高、形態(tài)完好的中期染色體制片,提高了制片效率和質(zhì)量。2.以沙地云杉基因組DNA為模板,通過PCR法擴增了18S rDNA和25S rDNA基因片段,測序后確定它們的序列分別為1472bp和364bp。經(jīng)BLAST分析兩個克隆序列與... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

FISH原理示意圖

（Ribosome），是細胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒，主要由 RNA（rRNA，其惟一功能是按照 mRNA 的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈，所內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機器[67]。原核生物和真核生物的核糖體均由大、[68]。S 為大分子物質(zhì)在超速離心沉降中的一個物理學(xué)單位，可間接反[69]。真核細胞核糖體的沉降系數(shù)為 80S，大亞基為 60S，約有 49 種蛋NA（28S rRNA、5S rRNA 和 5.8S rRNA)[70]，存在于大亞基中；小亞約 33 種蛋白質(zhì)和一種 18S rRNA[71]。核糖體被譽為“細胞的蛋白質(zhì)工碼核糖體 RNA 的基因，其測定序列常用來鑒別物種和鑒定物種同源PCR 技術(shù)和熒光染色技術(shù)相結(jié)合準確定位基因位置。編碼 18S、5.8S為 1 個轉(zhuǎn)錄單元，以中度重復(fù)的串聯(lián)多拷貝形式存在于染色體 DNA個位點上（如圖 2）。每個重復(fù)單元從 5ˊ到 3ˊ依次包含一個基因間ic spacer，IGS）、一個 18S rDNA 編碼區(qū)、一個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（in spacer，ITS）和一個 28S rDNA 編碼區(qū)，其中 ITS 區(qū)分為 ITS1 和 IT一個 5.8S rDNA 編碼區(qū)[72]。

11:10-11:50 和 13:00-13:40 切取的根尖經(jīng)染色體制片，統(tǒng)計單位視野面積內(nèi)處于中期的染色體數(shù)量（每個視野觀察 10-15 個細胞），經(jīng)多次對比試驗，發(fā)現(xiàn)：上午11:10-11:50 時的根尖制片可觀察到約 16-18%的中期分裂相，分散效果最理想。另兩個取材時間也觀察到了中期染色體，但獲得中期分裂相的概率僅為 3-4%。因此，上午 11:10-11:50 為最適宜的云杉根尖中期染色體制片取材時間。3.1.2 預(yù)處理條件的篩選試驗中做了 3 種不同的根尖預(yù)處理，觀察和統(tǒng)計每種預(yù)處理 100 張制片的染色體分裂情況和數(shù)目，從尼康顯微鏡拍攝的結(jié)果圖 3A 可以得知：0.1%秋水仙素（含 1%二甲基亞楓）對根尖處理 6.5 h 的時候效果最佳，得到的中期染色體分散程度高、染色體形態(tài)清晰，如圖 3B；冰水預(yù)處理得到的中期染色體分散性較差，如圖 4；飽和對二氯苯在處理根尖的過程中大多數(shù)染色體出現(xiàn)凝縮現(xiàn)象，如圖 3C。因此，在云杉根尖染色體制片時，用 0.1%秋水仙素（含 1%二甲基亞楓）處理 6.5 h 能夠獲得優(yōu)異的制片效果。

【參考文獻】：
期刊論文
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[6]熒光原位雜交技術(shù)的研究進展[J]. 何世斌,柴連琴,譚珺雋,沈堯,周萍,馬云峰,李立家.  植物科學(xué)學(xué)報. 2014(02)
[7]熒光原位雜交技術(shù)(FISH)及其在植物分子細胞遺傳學(xué)中的應(yīng)用與展望[J]. 林秀琴,毛鈞,陸鑫,劉新龍,馬麗,蔡青.  甘蔗糖業(yè). 2012(01)
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[10]核糖體的結(jié)構(gòu)和功能研究——2009年諾貝爾化學(xué)獎解讀[J]. 唐雅婷,劉克文.  中國校外教育. 2010(16)

碩士論文
[1]石蒜與忽地笑熒光原位雜交研究[D]. 程曉蕾.南京林業(yè)大學(xué) 2006
[2]我國幾種木本植物植原體的分子檢測與鑒定[D]. 李永.中國林業(yè)科學(xué)研究院 2004



本文編號：2946193