楊樹葉銹病是由落葉松-楊柵銹菌（Melampsora larici-populina）引起的非常嚴(yán)重的一種楊樹病害,在世界范圍內(nèi)造成重大損失。micro RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)20²4 nt的小分子單鏈非編碼RNA,能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、新陳代謝及響應(yīng)生物和非生物脅迫等過程。楊樹作為重要的的模式樹種,對(duì)于miRNA的研究已經(jīng)非常深入。國(guó)內(nèi)外對(duì)楊樹非生物脅迫下的miRNA研究主要集中在冷、熱、干旱、高鹽、機(jī)械壓力脅迫下miRNA的種類及其調(diào)控作用。但是在楊樹生物脅迫尤其是世界性重大病害的銹菌侵染下的miRNA的研究較少。本文通過高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析,鑒定受松-楊柵銹菌侵染下的川楊miRNA的種類,預(yù)測(cè)miRNA的靶基因,并對(duì)其中與抗病相關(guān)的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,最后構(gòu)建miRNA過表達(dá)載體,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入楊樹,從而深入了解楊樹受病原菌侵染時(shí)miRNA的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:1.受銹菌侵染川楊miRNA多樣性構(gòu)建非親和與親和性楊樹-柵銹菌互作條件下的楊樹s RNA文庫(kù),進(jìn)行高通量測(cè)序。在三個(gè)文庫(kù)中共鑒定得到90個(gè)已知的m... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

miRNA生物合成過程及功能特性（BrownandSanseau2005）

但是 AGO2 的作用和 miR403 指導(dǎo)的 AGO2 的調(diào)控的重要性還不得而知。圖 1-2 植物 miRNA 調(diào)控機(jī)制示意圖（Mallory and Vaucheret 2006）Figure 1-2 Schematic representation of plant miRNA regulatory mechanisms1.4 植物 miRNA 對(duì)脅迫響應(yīng)的調(diào)控隨著 miRNA 在不同生物中的大量發(fā)現(xiàn)，人們開始越來越多地研究 miRNA 的功能植物在生長(zhǎng)過程中，不可避免地要遭受各種生物脅迫和非生物脅迫的影響。長(zhǎng)期的進(jìn)也使植物形成了適應(yīng)各種脅迫的機(jī)制。在脅迫下 miRNA 的表達(dá)機(jī)制一直是 miRNA 能研究的重點(diǎn)。脅迫使植物過表達(dá)或者低表達(dá)特定的 miRNA 或合成新的 miRNAs 來控相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因的表達(dá)反過來又賦予植物抗逆性，許多 miRNAs 在植物于各種生物和非生物條件下被鑒定出來（Khraiwesh et al. 2012；Sunkar 2010；Sunkar aZhu 2012）。1.4.1 營(yíng)養(yǎng)脅迫植物在遭受營(yíng)養(yǎng)脅迫時(shí)，miRNA 可以調(diào)節(jié)體內(nèi)氮、磷、硫等元素的代謝平衡（Chiet al. 2007；Rhoades and Bartel 2004）。在磷、硫缺失的土壤中可以分別誘導(dǎo) miR399

引物和基因特異性引物反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò)增，電泳回收凝膠產(chǎn)物， T 載體中克隆、測(cè)序從而鑒定切割位點(diǎn)。被 miRNA-RISC 復(fù)合體切斷的 m的 mRNA 不同，完整的 mRNA 有 5’帽子結(jié)構(gòu)，所以不能連接 RNA 接頭， PCR 時(shí)不能被擴(kuò)增。被切割的靶基因 mRNA 相對(duì)于隨機(jī)斷裂的 mRNA，其固定的。5’RLM-RACE 方法驗(yàn)證靶基因已在很多植物研究中被廣泛應(yīng)用，而效的（Jones-Rhoades and Bartel. 2004；Lu et al. 2005, 2007）。.3.3 靶基因的功能分析植物遺傳轉(zhuǎn)化是應(yīng)用重組 DNA 技術(shù)，將外源基因?qū)胫参锘蚪M從而獲源基因的轉(zhuǎn)基因植株的技術(shù)（許農(nóng)等 1991）。農(nóng)桿菌因其有能將外源基因體內(nèi)的能力，常用來作為遺傳轉(zhuǎn)化的載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在植物泛的應(yīng)用（Pitzschke and Hirt 2010）。農(nóng)桿菌與植物互作過程見圖 1-4，植物，在創(chuàng)傷部位釋放信號(hào)，農(nóng)桿菌 VirA/G 區(qū)被激活，從而合成 T-DNA，vir 基過細(xì)菌的 T4SS 分泌系統(tǒng)將 T-DNA 和 Vir 蛋白轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，形成 T-DNA合物。這個(gè)復(fù)合物被運(yùn)到寄主細(xì)胞核，通過非常規(guī)重組整合到寄主染色體（d Hirt 2010）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：2945833