磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素,熱帶和亞熱帶地區(qū)土壤中有效磷的缺乏是制約農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)量提高的重要限制性因子。發(fā)掘與利用植物耐低磷相關(guān)基因,創(chuàng)制磷高效利用新種質(zhì)是解決上述問(wèn)題的有效途徑。馬尾松作為我國(guó)重要的本土樹(shù)種,在農(nóng)林經(jīng)濟(jì)上有著重要的價(jià)值,然而南方土壤有效磷缺乏嚴(yán)重影響馬尾松的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量,因此挖掘低磷脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因具有重要的意義,為馬尾松的抗低磷分子育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。在前期工作基礎(chǔ)中,基于馬尾松低磷脅迫RNA-Seq數(shù)據(jù),篩選到了4個(gè)差異表達(dá)馬尾松WRKY轉(zhuǎn)錄本序列。本文以馬尾松耐低磷種質(zhì)為材料,獲得了顯著差異表達(dá)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子Unigene,并對(duì)其在重度低磷脅迫下時(shí)空差異表達(dá)進(jìn)行分析;利用熒光定量PCR對(duì)低磷脅迫響應(yīng)WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選,采用RACE方法克隆了應(yīng)答低磷脅迫的WRKY轉(zhuǎn)錄因子(PmWRKY164)全長(zhǎng)序列,構(gòu)建了表達(dá)載體并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)RT-PCR與熒光定量PCR相結(jié)合,檢測(cè)了4個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子Unigenes在低磷脅迫中表達(dá)情況。結(jié)果表明,在重度低磷P_1(營(yíng)養(yǎng)液磷含量0.5mg/L)脅迫下,WRKY164在整個(gè)低磷脅迫中持續(xù)上調(diào)表達(dá)。2.利用RACE技術(shù),克隆出WRKY164全長(zhǎng)序列,命名為PmWRKY164。序列分析表明,PmWRKY164全長(zhǎng)共1,977 bp;完整開(kāi)放閱讀框(ORF)為1,164 bp,5’-UTR大小為65 bp,3’-UTR大小為748 bp,共編碼387個(gè)氨基酸。3.生物信息學(xué)分析表明,PmWRKY164蛋白序列中存在WRKY家族結(jié)構(gòu)區(qū)域,為WRKY家族里第Ⅱb類WRKY成員;同源性分析表明,PmWRKY164在WRKY家族保守區(qū)域上與其他植物相似性較高。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,PmWRKY164與紅豆杉和銀杏親緣關(guān)系最接近。4.組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),PmWRKY164為組成型表達(dá),在根、莖、葉中均有表達(dá),葉中表達(dá)量最高,根中次之,莖中最低。在根和莖中,36 d的表達(dá)量最低,60 d的表達(dá)量最高;而在葉中,12 d的表達(dá)量最低,60 d的表達(dá)量最高;除了葉中的表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)以外,根、莖表達(dá)量均呈現(xiàn)上升-下降-上升的趨勢(shì)。5.構(gòu)建了PmWRKY164基因超表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將PmWRKY164基因轉(zhuǎn)化模式植物煙草。經(jīng)過(guò)篩選與PCR分子檢測(cè),成功鑒定了20個(gè)能正常表達(dá)外源基因轉(zhuǎn)基因煙草株系;經(jīng)qRT-PCR檢測(cè),從轉(zhuǎn)基因煙草中篩選出3個(gè)表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系(Line-2、Line-3、Line-8)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。6.對(duì)轉(zhuǎn)基因與野生型煙草進(jìn)行不同濃度磷脅迫處理,檢測(cè)其生理生化反應(yīng)。結(jié)果表明低磷脅迫下,除了MDA含量低于野生型之外,磷含量、Apase活性、POD活性及SOD活性在轉(zhuǎn)基因煙草中均顯著高于野生型;而正常磷及高磷條件下,轉(zhuǎn)基因與野生型植株并無(wú)明顯差異。因此,推測(cè)超表達(dá)PmWRKY164基因顯著提高了植株的耐低磷能力。7.超表達(dá)PmWRKY164基因?qū)煵萘邹D(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHO1的表達(dá)分析顯示,在低磷條件下轉(zhuǎn)基因植株冠部PHO1含量顯著高于野生型;在正常供磷條件下,該基因表達(dá)量在野生型與轉(zhuǎn)基因植株中無(wú)顯著差別,這意味著PmWRKY164對(duì)煙草PHO1作用明顯,可能通過(guò)正調(diào)控而促進(jìn)PHO1的表達(dá),從而促進(jìn)植株對(duì)磷的吸收,提高植株耐低磷脅迫的能力。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S791.248
【部分圖文】：

圖 1-1 Ⅰ（Ⅰ-N 端和Ⅰ-C 端）、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd+Ⅱe 和Ⅲ五類 WRKY 轉(zhuǎn)WRKY 結(jié)構(gòu)域注：陰影部分代表 WRKY 結(jié)構(gòu)域中內(nèi)含子的位置Fig. 1-1 Ⅰ（Ⅰ-N andⅠ-C）、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd+Ⅱe and Ⅲ, Five kinds otranscription factor WRKY domain.Note: The shadow part represents the intron position in the WRKY dom

低磷脅迫馬尾松材料

圖 2-2 低磷脅迫對(duì)馬尾松含量的影響A: 總磷含量 B: 無(wú)機(jī)磷含量注：R：根 L+S：葉和莖Figure 2-2 Effect of low phosphorus stress on phosphorus content in Pinus massonianaA: Total phosphorus content; B: Inorganic phosphorus contentNote: R: Root L+S: Leaf and Stem
【參考文獻(xiàn)】

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