蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)可以產(chǎn)生多種殺蟲(chóng)蛋白,如營(yíng)養(yǎng)期的Vip蛋白和芽胞期形成的Cry晶體蛋白。由于Bt殺蟲(chóng)蛋白對(duì)鱗翅目、鞘翅目和雙翅目等多種害蟲(chóng)具有特異的殺蟲(chóng)效果,因此被廣泛用于轉(zhuǎn)基因作物中。然而在轉(zhuǎn)Bt作物的廣泛種植過(guò)程中,其顯著的抗蟲(chóng)效果被靶標(biāo)昆蟲(chóng)所產(chǎn)生的抗性日益削減。而兩種或多種Bt蛋白組合不僅能有效克服或延緩靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Bt蛋白抗性的產(chǎn)生,而且能擴(kuò)大殺蟲(chóng)譜;其中,特定的蛋白組合還能產(chǎn)生協(xié)同增效作用,顯著提高殺蟲(chóng)活性。在前期研究中發(fā)現(xiàn)Cry9Aa和Vip3Aa蛋白組合對(duì)水稻二化螟(Chilo suppressalis)具有顯著的協(xié)同增效殺蟲(chóng)效果。但迄今為止全世界范圍內(nèi)關(guān)于Cry和Vip蛋白之間的增效作用機(jī)制的研究仍為空白。本研究首先對(duì)Cry9Aa和Vip3Aa蛋白對(duì)水稻二化螟的協(xié)同增效殺蟲(chóng)機(jī)制進(jìn)行了深入的研究,在此基礎(chǔ)上,開(kāi)展了對(duì)玉米害蟲(chóng)高效的Bt蛋白組合篩選,主要進(jìn)展如下:1.證明了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白與BBMV存在特異性結(jié)合;明確了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白在BBMV上存在不同的受體結(jié)合位點(diǎn)。2.發(fā)現(xiàn)了Cry9Aa和V...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 蘇云金芽胞桿菌Cry蛋白
        1.1.1 3d-Cry蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 3d-Cry蛋白對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)作用機(jī)制
        1.1.3 其它Cry蛋白
    1.2 蘇云金芽胞桿菌Vip蛋白
        1.2.1 Vip3蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 Vip3蛋白殺蟲(chóng)作用機(jī)制
        1.2.3 其它Vip蛋白
    1.3 協(xié)同增效殺蟲(chóng)作用機(jī)制
        1.3.1 Cry和Vip蛋白之間的增效作用
        1.3.2 Cry和Cyt蛋白的增效作用
        1.3.3 Cry蛋白和受體鈣粘蛋白的增效作用
        1.3.4 Cry蛋白之間的增效作用
        1.3.5 Cry蛋白和其它物質(zhì)的增效作用
    1.4 昆蟲(chóng)對(duì)蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)蛋白的抗性機(jī)制
    1.5 本研究涉及的主要鱗翅目害蟲(chóng)
        1.5.1 水稻二化螟
        1.5.2 亞洲玉米螟
        1.5.3 東方粘蟲(chóng)
    1.6 本研究涉及的蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)蛋白
        1.6.1 Cry9Aa和Cry9Ee蛋白
        1.6.2 Vip3Aa蛋白
        1.6.3 Cry1Bb蛋白
    1.7 研究目的、意義和立題依據(jù)
    1.8 主要研究?jī)?nèi)容
        1.8.1 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白組合在水稻二化螟B(niǎo)BMV上的結(jié)合分析
        1.8.2 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之間的結(jié)合分析
        1.8.3 Cry9Aa與Vip3Aa蛋白結(jié)合位點(diǎn)的確定
        1.8.4 對(duì)兩種玉米害蟲(chóng)具有協(xié)同增效殺蟲(chóng)活性的Bt蛋白組合篩選
        1.8.5 亞洲玉米螟對(duì)Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的交互抗性機(jī)制分析
第二章 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白與BBMV的結(jié)合以及兩蛋白間的結(jié)合分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株信息
        2.1.2 供試?yán)ハx(chóng)
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        2.1.4 培養(yǎng)基與抗生素
        2.1.5 常用溶液與緩沖液
        2.1.6 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 蛋白的提取
        2.2.2 蛋白的親和純化
        2.2.3 蛋白的活化
        2.2.4 蛋白的凝膠過(guò)濾純化
        2.2.5 Bradford法測(cè)定蛋白濃度
        2.2.6 蛋白的生物素標(biāo)記
        2.2.7 BBMV的提取
        2.2.8 APN酶活測(cè)定
        2.2.9 Cry9Aa(或Vip3Aa)與BBMV的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 Cry9Aa(或Vip3Aa)與BBMV的同源競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 Cry9Aa(或Vip3Aa)與BBMV的異源競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        2.2.12 Ligand-blot實(shí)驗(yàn)
        2.2.13 ELISA實(shí)驗(yàn)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的提取與純化
        2.3.2 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的活化
        2.3.3 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的凝膠過(guò)濾純化
        2.3.4 Western-blot檢測(cè)Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的生物素標(biāo)記情況
        2.3.5 BBMV的提取與APN酶活測(cè)定
        2.3.6 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白與BBMV飽和結(jié)合情況
        2.3.7 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白與BBMV同源競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況
        2.3.8 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白與BBMV異源競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況
        2.3.9 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之間的Ligand-blot結(jié)合分析
        2.3.10 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之間的ELISA結(jié)合分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 Cry9Aa蛋白協(xié)同增效關(guān)鍵位點(diǎn)的確定
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 引物
        3.1.3 供試?yán)ハx(chóng)
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        3.1.5 常用溶液與緩沖液
        3.1.6 主要儀器設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與序列比對(duì)分析
        3.2.2 PCR克隆Cry9Aa各結(jié)構(gòu)域片段
        3.2.3 DNA片段雙酶切及純化
        3.2.4 連接反應(yīng)
        3.2.5 電擊轉(zhuǎn)化
        3.2.6 陽(yáng)性克隆的鑒定
        3.2.7 熱激轉(zhuǎn)化
        3.2.8 合成多肽的結(jié)合分析
        3.2.9 Cry9Aa突變體的構(gòu)建
        3.2.10 Cry9Aa突變體蛋白提取、純化與定量
        3.2.11 水稻二化螟殺蟲(chóng)活性測(cè)定
        3.2.12 增效因子的計(jì)算
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 Cry9Aa蛋白的結(jié)構(gòu)與疏水性分析
        3.3.2 Cry9Aa蛋白結(jié)構(gòu)域的分段表達(dá)
        3.3.3 Cry9Aa各結(jié)構(gòu)域片段與Vip3Aa蛋白的結(jié)合分析
        3.3.4 Cry9Aa的loop突變體與Vip3Aa蛋白的結(jié)合分析
        3.3.5 Cry9Aa合成肽段與Vip3Aa蛋白的結(jié)合情況分析
        3.3.6 Cry9Aa參與結(jié)合的表位分析
        3.3.7 Cry9Aa突變體的構(gòu)建與表達(dá)
        3.3.8 Cry9Aa突變體與Vip3Aa蛋白的結(jié)合分析
        3.3.9 水稻二化螟殺蟲(chóng)活性測(cè)定
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 Vip3Aa蛋白協(xié)同增效關(guān)鍵位點(diǎn)的確定
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 質(zhì)粒信息
        4.1.2 引物
        4.1.3 供試?yán)ハx(chóng)
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 Vip3Aa蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.0 Vip3Aa蛋白重疊片段的構(gòu)建與表達(dá)
        4.3.1 Vip3Aa重疊片段與Cry9Aa蛋白的結(jié)合情況分析
        4.3.2 Vip3Aa合成多肽與Cry9Aa蛋白的結(jié)合分析
        4.3.3 Vip3Aa蛋白突變體的構(gòu)建與表達(dá)
        4.3.4 Vip3Aa突變體與Cry9Aa蛋白的結(jié)合分析
        4.3.5 Vip3Aa蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬
        4.3.6 水稻二化螟的殺蟲(chóng)活性測(cè)定
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 對(duì)玉米害蟲(chóng)協(xié)同增效Bt殺蟲(chóng)蛋白組合的篩選
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌株與質(zhì)粒
        5.1.2 引物
        5.1.3 供試?yán)ハx(chóng)
        5.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.1.5 常用溶液與緩沖液
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 Bt殺蟲(chóng)基因的克隆
        5.2.2 DNA片段雙酶切及純化
        5.2.3 連接反應(yīng)
        5.2.4 熱激轉(zhuǎn)化
        5.2.5 陽(yáng)性克隆的鑒定
        5.2.6 HD73-無(wú)晶體突變株感受態(tài)制備
        5.2.7 電擊轉(zhuǎn)化
        5.2.8 晶體形態(tài)觀察
        5.2.9 亞洲玉米螟和東方粘蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性測(cè)定
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        5.3.1 Cry9Ee蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.3.2 Cry9Ee蛋白在Bt中的表達(dá)
        5.3.3 Cry9Ee蛋白的提取
        5.3.4 Cry1Bb蛋白的載體構(gòu)建與表達(dá)
        5.3.5 Cry1Bb蛋白Ni親和純化
        5.3.6 Cry1Ah和Cry1Ie蛋白的提取與純化
        5.3.7 亞洲玉米螟及東方粘蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性測(cè)定
        5.3.8 亞洲玉米螟B(niǎo)BMV的提取和定量
        5.3.9 Cry9Ee與Cry1Ab在BBMV上的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3786327