辣椒（Capsicum annuum L.）作為我國重要的蔬菜,是一種典型的土傳病害多的茄科作物,常常發(fā)生病害,特別是在高溫高濕條件下,病害頻發(fā)且嚴重,影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)。研究辣椒抗病分子機制,有利于開展辣椒抗病遺傳改良和培育抗病新品種。作為在高等植物中成員種類最多的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛地參與到植物各種生理生化過程的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)當(dāng)中,特別在植物對各種外源病原菌入侵及其它生境逆境防御反應(yīng)的響應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用,剖析WRKY轉(zhuǎn)錄因子中各個成員在植物的抗病或耐逆中所存在的作用,是研究植物抗病或耐逆相關(guān)分子調(diào)控機制的重要內(nèi)容以及可行方案。雖然前人研究發(fā)現(xiàn)CaWRKY6,CaWKRY27,CaWRKY40和CaWRKY58等辣椒WRKY家族成員在辣椒應(yīng)答其重要土傳病原菌青枯菌接種（RSI）或高溫高濕（HTHH）逆境脅迫中起作用,但其分子仍不是很清楚。本研究通過酵母雙雜交,分離獲得CaWRKY40的互作蛋白CaWRKY71,并對Ca WRKY71的表達以及CaWRKY71與CaWRKY40互作在辣椒應(yīng)答青枯病中的作用進行了研究,主要結(jié)果如下:（1）序列分析表明,Ca WR... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－１?（ａ）辣椒ＣａＷＲＫＹ７１與其他物種中同源性相對較高的蛋白的氨基酸序列比對

Ｃ．ａＷＲＫＹ７１及其－Ｌｊ?ＣａＷＲＫＹ４０互作在辣椒應(yīng)答青枯保ｉ侵染中的作用??元件。其中含有多個ＨＳＥ應(yīng)答相關(guān)元件，暗示了其與高溫脅迫的關(guān)系，并含有??三個保守的Ｗ－ｂｏｘ，這一結(jié)果暗示了該基因的表達極有可能與多種植物激素有??關(guān)，并且在逆境處理以及其他的ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)錄因子的作用下受到調(diào)控（圖３－２ａ）。??通過提�。溉~期辣椒幼苗在青枯菌接種１２?ｈ以及２４?ｌｉ葉片的ｍＲＮＡ，并通過反??轉(zhuǎn)錄ＰＣＲ制作成ｃＤＮＡ文庫作為模板，通過實時熒光定量ＰＣＲ分析ＣＶ／．／０７／??對青枯菌侵染的應(yīng)答水平，我們發(fā)現(xiàn)該基因?qū)η嗫菥秩镜膽?yīng)答明顯，該基因??的表達量在丨２?ｈ以及２４?ｈ都發(fā)生很明顯的提高（圖３－２ｂ）。我們對８葉期辣椒幼??苗的葉片噴施外源植物激素，并于２４?ｈ對辣椒葉片進行采樣，提�。遥危�，并逆??轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ后用實時熒光定量ＰＣＲ測定在不同植物激素處理下的??表達水平，發(fā)現(xiàn)在外源激素ＳＡ和ＥＴＨ的作用下被激活，而對其他??激素?zé)o明顯應(yīng)答（圖３－２ｃ）。以上結(jié)果表明Ｑ／ＷＷＦ７７能在青枯菌侵染下被激活，??表達量明顯提高，并且應(yīng)答的是由乙烯利以及水楊酸介導(dǎo)的信號通路，這意味??著ｃｗｒａ／ｒｙｖ／很可能在辣椒應(yīng)答青枯菌脅迫的抗逆反應(yīng)相關(guān)信號通路中起到一??定作用。??ＣａＷＲＫＹ７１?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??ａ??－２０００?－１５００?－１０００?－５００?０??Ｈ——－Ｈ－ｌｌｌ－ＩＨｆｒｉ－Ｈ｝１１??■?ＡＢＲＥ?｜?ＥＲＥ?｜?Ｗ－ｂｏｘ?屋?ＨＳＥ??ＴＣＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ??ｂ?＾?ｉ?１?ＲＳＩ?ｉ?１?Ｍｏｃｋ??°?＾??－令?［．ｉ??１?４－?Ａ?ｉ?令?－４?ｉ

結(jié)果與分析??圖３－４瞬間超表達對細胞死亡以及與免疫相關(guān)防御基因的表達??（ａ）通過ｒｃａｌ－ｔｉｉｎｃ?ＲＴ－ＰＣＲ檢測表達效率。（ｂ）通過ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ檢測顯性抑制子表達效??率。（ｃ）瞬間超表達３５Ｓ：：Ｃｒｔ（Ｗ？夂Ｆ７／引起的過敏反應(yīng)，圖中顯示的分別為侵染４天后的白光??及ＵＶ燈下表型。分別采用ＤＡＢ染色和Ｔｒｙｐａｎ?ｂｌｕｅ染色兩種組織化學(xué)染色方法檢測瞬間超??表達３５Ｓ：：ＣＶ／Ｆ／？人Ｔ７／引起的細胞死亡和過氧化物積累。農(nóng)桿菌注射３６ｈ和６０ｌｉ后，測電導(dǎo)??率。（ｄ）將含Ｃ？ｆＴＯＡＴ７／和空載體的農(nóng)桿菌ＧＶ３１０１，?０Ｄ＿調(diào)至０．４，注射后不同時間點做??電導(dǎo)率測定。（ｅ）在辣椒葉片上瞬間超表達３５Ｓ：：ＣｆｌｆＷ？／Ｑ７７、３５Ｓ：：Ｃｆｌｆ＿ｒａ人７７／－５７仍１和??３５Ｓ：：（％／，分別于１２?ｈ，?２４?ｈ，?３６?ｈ后采樣＿。通過ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ檢測與免疫和耐熱性相關(guān)??標記基因的表達。用方差分析表示四個獨立的生物學(xué)重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)。按照Ｆ測驗保護最小??顯著差數(shù)法的分析，極顯著差異用不同的大寫字母表示（戶＜０．０１）？??Ｆｉｇ．３－４?Ｃｅｌｌ?ｄｅａｔｈ?ａｎｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｉｍｍｕｎｉｔｙ?ｏｒ?ｔｈｅｍｉｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ?ｍａｒｋｅｒ?ｇｅｎｅｓ?ｗｅｒｅ??ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ?ｂｙ?ｔｒａｎｓｉｅｎｔ?ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＣｃｉＷＲＫＹ７１??（ａ）?Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，?（ｂ）?Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ?ａｎａｌｙｓ

【參考文獻】：
期刊論文
[1]辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒別及進化分析[J]. 刁衛(wèi)平,王述彬,劉金兵,潘寶貴,郭廣君,戈偉.  華北農(nóng)學(xué)報. 2014(06)
[2]檉柳ThERF1基因上游調(diào)控因子W-box互作蛋白[J]. 臧丹丹,劉文進,王玉成.  東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2014(02)

博士論文
[1]棉花衰老相關(guān)WRKY基因的克隆與功能分析[D]. 竇玲玲.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016



本文編號：3257031