草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)屬于花椰菜花葉病毒屬,本研究克隆了SVBV安徽分離物(SVBV-AH)的全長(zhǎng)基因組;利用SVBV-AH全長(zhǎng)成功完成侵染性克隆的構(gòu)建,明確了安徽分離物侵染森林草莓(Fragaria vesca)引起的表型。本課題組已證明SVBV編碼的P6蛋白是一個(gè)沉默抑制子、反式激活因子和癥狀決定子,與致病性密切相關(guān)。但迄今為止,SVBV P6蛋白與森林草莓蛋白互作的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組構(gòu)建感染SVBV的森林草莓酵母cDNA文庫(kù),以P6為誘餌蛋白篩選出與其互作的寄主因子半胱氨酸蛋白酶RD21。利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)(Y2H)驗(yàn)證P6蛋白和RD21蛋白在體外互作,且RD21蛋白能抑制P6在植物體內(nèi)的表達(dá),為進(jìn)一步揭示SVBV P6蛋白與草莓半胱氨酸蛋白酶RD21互作分子機(jī)制為研究寄主植物和病毒之間防御和反防御機(jī)理奠定基礎(chǔ)。1 SVBV安徽分離物全長(zhǎng)基因組的克隆提取于安徽長(zhǎng)豐采集到的疑似被SVBV侵染的草莓樣本總DNA。PCR以此為模板分段擴(kuò)增出SVBV-AH片段,拼接后獲得pSVBV-AH全長(zhǎng)基因組。SVBV-AH基因組序列全長(zhǎng)7862 bp,序列登錄號(hào)為KX787430。比對(duì)基因組全序列發(fā)現(xiàn),SVBV-AH與SVBV-BJ及SVBV-SY全基因組序列相似性極高,分別達(dá)到97.7%和98.5%,與SVBV-US的序列相似性較高達(dá)到85.6%,而與花椰菜花葉病毒屬(Caulimovirus)其他成員全長(zhǎng)基因組序列相似性較低,僅達(dá)到43.4%~44.7%。進(jìn)一步比對(duì)各ORFs核苷酸序列發(fā)現(xiàn)SVBV-AH和SVBV-US的ORF II序列差異最大,相似性僅為69.6%,ORF V序列差異最小,相似性為86.5%,說(shuō)明SVBV在和草莓相互適應(yīng)過(guò)程中不會(huì)因?yàn)榈乩砀綦x發(fā)生較大的變異。2 SVBV-AH侵染性克隆的構(gòu)建及其侵染性鑒定利用SVBV全長(zhǎng)基因組克隆pSVBV-AH構(gòu)建SVBV-AH侵染性克隆pBIN-1.25AHSVBV,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,接種森林草莓驗(yàn)證侵染性。6周后觀察發(fā)現(xiàn),接種SVBV-AH侵染性克隆的森林草莓表現(xiàn)明顯的葉脈鑲邊黃化癥狀,而接種pBINPLUS的栽培草莓不表現(xiàn)明顯癥狀。Southern blot檢測(cè)表明,SVBV-AH侵染性克隆可以成功侵染森林草莓。3酵母雙雜(Y2H)驗(yàn)證P6與RD21互作pGBK-P6+pGAD-RD21、pGBK-P6+pGAD-RD21分別共轉(zhuǎn)化酵母Y2H;在SD/-Ade/-His和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)化的酵母菌能夠在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng),說(shuō)明P6能夠與RD21在體外互作。4森林草莓RD21基因的序列比較及分子進(jìn)化分析將本研究克隆獲得的森林草莓RD21基因與已登錄在GenBank的其他植物的RD21基因進(jìn)行核甘酸序列相似性比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),森林草莓半胱氨酸蛋白酶RD21的核苷酸序列與同屬薔薇科的梅花(Prunus mume)、蘋(píng)果(Malus x domestica)、櫻桃(Prunus avium)、梨(Pyrus x bretschneider)和桃(Prunus persica)的核苷酸序列相似性較高,為83.5%-84.8%,與其他植物RD21基因序列的相似性較低,為67.4%-76.5%。構(gòu)建森林草莓RD21基因和其他植物RD21基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù),結(jié)果表明森林草莓RD21基因與同屬薔薇科植物的梅花(P.mume)、蘋(píng)果(M.domestica)、櫻桃(P.avium)、梨(P.bretschneideri)和桃(P.persica)RD21基因單獨(dú)聚為一個(gè)分支,表明森林草莓RD21基因與薔薇科植物RD21基因的親緣關(guān)系最近。5 Real-time PCR分析森林草莓RD21基因的RNA積累水平SVBV-US侵染性克隆侵染森林草莓35天后,提取發(fā)病新葉總RNA,Real-time PCR分析接種空菌株草莓和接毒草莓中RD21基因的表達(dá)差異,結(jié)果表明,SVBV-US侵染的森林草莓中RD21表達(dá)上調(diào)。6森林草莓RD21亞細(xì)胞定位及與P6蛋白共定位分析含質(zhì)粒pCM2300-RD21-GFP和pCM2300-P6-RFP的農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)本氏煙,結(jié)果表明,RD21蛋白能夠定位于本氏煙的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核邊界,共定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),P6蛋白能夠與RD21蛋白共定位于細(xì)胞邊界。7森林草莓RD21抑制P6在植物體內(nèi)的表達(dá)將含有pGR106-P6-GFP/pGR106和pGR106-P6-GFP/pGR106-RD21表達(dá)載體的農(nóng)桿菌分別注射本氏煙,4天后UV燈下觀察熒光發(fā)現(xiàn),pGR106-P6-GFP/pGR106-R D21浸潤(rùn)的葉片中綠色熒光較弱,提取浸潤(rùn)區(qū)蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)不到P6蛋白的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)P6 mRNA發(fā)現(xiàn),P6 mRNA表達(dá)水平一致,說(shuō)明RD21蛋白能夠抑制P6-GFP的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.68
【部分圖文】：

圖 1-1 SVBV 基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 Genomic organization of SVBV毒侵染性克隆于植物中時(shí)應(yīng)具有如下特點(diǎn)：1. 病毒復(fù)制組較小易于體外操作；3. 侵染性克隆方便克隆，而其中雙生病毒應(yīng)用范圍最廣泛，A病毒也是早期被用于制備侵染性克隆的些局限性，如易重組、復(fù)制和組裝能力有圍越來(lái)越廣泛，這一切都得益于逆轉(zhuǎn)錄酶性克隆可用以研究病毒各個(gè)基因的功能制和寄主的互作等，從中我們可以獲取大的發(fā)展，如今植物病毒的侵染性克隆可被[22,23]

pC2-0.5SVBV-AH。（2）以 AH-C1-F 和 AH-C1-R 為引物，以 AHSVBV-II 為模版獲得片段，命名AHSVBV-III，與線性化載體 pC1-SVBV-I（Sal I/Kpn I）以重組法相連，得pC1-0.75SVBV-AH。（3）限制性內(nèi)切酶 Bsp1407 I/Sma I 酶切 pC2-0.5SVBV-AH，得到純化產(chǎn)物 0.5SVB（Bsp1407 I/Sma I），與線性化載體 pC1-0.75SVBV（Bsp1407 I/Sma I）連接，到 pC1-1.25AHSVBV。（4）限制性 Sal I/Sma I 酶切 pC1-1.25AHSVBV 后，經(jīng)膠回收后獲得 1.25AHSVBV（SI/Sma I）純化產(chǎn)物，直接與載體 pBINPLUS（Sal I/Sma I）連接，獲得質(zhì)pBIN-1.25AHSVBV。

圖 4-2 SVBV-AH 基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Fig. 4-2 Structural characteristics of SVBV-AH genome 基因組序列與另外 16 個(gè)花椰菜花葉病毒屬（列（表 4-2），結(jié)果發(fā)現(xiàn) SVBV-AH 全長(zhǎng)基因高，分別為 98.5%和 97.7%，與 SVBV-US 的VBV-AH 基因組全長(zhǎng)序列與其他 13 個(gè) Cauli3.4%~44.7%（表 4-3）。 ORFs 編碼的氨基酸序列與已知的 SVBV 其他BV-AH 和 SVBV-US 的 ORF II 序列差異最大，，相似性為 93.4%。對(duì)比 4 個(gè) SVBV 序列也似性高達(dá) 93.4%~99.0%，此外 SVBV-AH 和 S酸序列相似性極高，為 95.1%~99.0%，說(shuō)明 S地理隔離發(fā)生較大的變異。 Caulimovirus 其他 13 個(gè)成員各 ORFs 氨基酸
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 葉云天;婁可飛;王熙然;劉勇強(qiáng);陳清;湯浩茹;;森林草莓B-box基因家族全基因組序列鑒定與表達(dá)分析[J];分子植物育種;2016年04期

2 董靜;王桂霞;鐘傳飛;常琳琳;孫健;張宏力;孫瑞;石琨;隗永青;張運(yùn)濤;;森林草莓醇�；D(zhuǎn)移酶基因FvAATW2功能研究[J];園藝學(xué)報(bào);2018年01期

3 苗立祥;張?jiān)コ?楊肖芳;蔣桂華;;森林草莓全基因組WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的鑒定與分析[J];核農(nóng)學(xué)報(bào);2012年08期

4 雷家軍;范雯;王善光;代漢萍;;五倍體野生草莓花粉性狀及減數(shù)分裂的觀察[J];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年04期

5 林瑩;韓玉輝;熊思嘉;李澤斌;張欣;顧婷婷;;森林草莓組蛋白去乙�；富虻蔫b定和分析[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2017年02期

6 王靜;趙密珍;王壯偉;吳偉民;錢(qián)亞明;;森林草莓精氨酸脫羧酶基因的電子克隆與序列分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2011年03期

7 時(shí)翠平;牛樹(shù)啟;葛會(huì)波;;草莓屬植物染色體核型分析(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2011年01期

8 時(shí)翠平;牛樹(shù)啟;葛會(huì)波;;草莓屬植物染色體核型分析[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年13期

9 雷家軍;楊高;代漢平;吳祿平;鄧明琴;;我國(guó)的草莓野生種質(zhì)資源[J];果樹(shù)科學(xué);1997年03期

10 江彤;張漢平;謝朝陽(yáng);陳靜;馮明峰;;草莓鑲脈病毒侵染性克隆的構(gòu)建[J];植物病理學(xué)報(bào);2016年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張?jiān)コ?森林草莓黃果表型形成機(jī)制研究[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 翁天均;基于45S rDNA-FISH與GISH分析的草莓屬（Fragaria）野生種親緣關(guān)系與系統(tǒng)分類研究[D];西南大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張享享;草莓鑲脈病毒移動(dòng)蛋白P1和森林草莓葉綠素a/b結(jié)合蛋白LHC Ⅱ互作機(jī)制研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 蔣西子;SVBV-AH侵染性克隆的構(gòu)建及森林草莓RD21蛋白與SVBVP6蛋白的互作[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 左登攀;森林草莓鋅指蛋白ZFP介導(dǎo)SVBV P6蛋白泛素化的機(jī)制研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 韓玉輝;森林草莓中組蛋白甲基化修飾酶基因的鑒定與分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 駱慧楓;森林草莓花青素下降突變體RAP基因的克隆與功能解析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

6 尹歡;葡萄bHLH與森林草莓NBS-LRR基因的全基因組分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 陳靜;草莓鑲脈病毒P6基因致病機(jī)制研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 楊迎春;森林草莓中反應(yīng)調(diào)控因子的鑒定及表達(dá)模式分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 張穎君;草莓屬（Fragaria）植物親緣關(guān)系的RAPD研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

10 張漢平;草莓鑲脈病毒抑制沉默機(jī)制及其中國(guó)分離物侵染性鑒定[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2845789